Key Difference – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriktionsendonukleaser er specifikke enzymer, som skærer dobbeltstrenget DNA (dsDNA). De er også kendt som molekylær sakse i molekylærbiologi. Restriktionsenzymer er i stand til at genkende specifikke korte sekvenser af dsDNA'et kendt som genkendelsessteder og sp alte phosphodiester- og hydrogenbindinger for at åbne dobbeltstrenge. Som et resultat af sp altning af disse enzymer produceres DNA-fragmenter med forskellige typer ender såsom klæbrige ender og stumpe ender. DNA-ligase er et enzym, der bruges i molekylærbiologi til at forbinde to tilstødende DNA-strenge ved at danne nye bindinger. Trinnet er kendt som ligering, og i henhold til typen af den ligerede DNA-ende kan de omtales som ligering af stumpe ende og ligering af klæbrig ende. Den vigtigste forskel mellem ligering af stump og klæbrig ende er, at ligering af stump ende forekommer mellem DNA-fragmenter, der indeholder to stumpe ender, mens ligering af klæbrig ende forekommer mellem 5' og 3' udhæng. Sammenlignet med ligering med stump ende er ligering af klæbrige ende mere effektiv og stabil.
Hvad er en Blunt End Ligation?
Nogle restriktionsendonukleaser kan skære DNA'et ved de modsatte baser og producere stumpende DNA-fragmenter. Disse enzymer er kendt som blunt end cutters; de sp alter lige ned til midten af restriktionsstedet uden at efterlade enkeltstrengede overhængende baser. Stumpe ender er også kendt som ikke-overhængende ender, da de ikke har 3' og 5' overhængende baser i enderne. Begge strenge ender fra basepar i stumpe ender. Almindelige stumpende skærende enzymer er EcoRV HaeIII, AluI og SmaI.
Blunt end ligering er involveret mellem to stumpe ender. Det er ikke en ligering af fremspringende baser. Denne ligering er mindre effektiv end sticky end ligering. I nogle tilfælde bliver ligering med stump ende mere fordelagtig end ligering af klæbrige ende, især ved ligering af PCR-produkter. PCR-produkter fremstilles altid med stumpe ender. Ligering med stump ende kræver ikke komplementære ender i DNA'et til ligeringen.
Figur 01: Blunt end-produktion af Eco RV-enzym
Hvad er en Sticky End Ligation?
Nogle restriktionsendonukleaser er i stand til at skære dsDNA og efterlader et overhængende stykke enkeltstrenget DNA i enden. Disse ender er kendt som klæbrige eller overhængende ender. Klæbende endeligering forekommer mellem to DNA-fragmenter, som indeholder matchende udhæng, fordi klæbrige ender har uparrede baser og kræver komplementære baser for at danne bindinger. Derfor er det nødvendigt at bruge det samme restriktionsenzym for begge DNA-kilder for at producere de matchende ligeringsfragmenter.
Klæbende endeligering er mere effektiv og er ofte yderst ønskelig i kloningsprocesser. Der er flere restriktionsenzymer, som producerer klæbrige ender. De er EcoRI, BamHI, HindIII osv.
Figur 02: Sticky end-produktion af Eco RI-enzym
Hvad er forskellen mellem Blunt og Sticky End Ligation?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Blunt-endeligering forekommer mellem to stumpende DNA-fragmenter. | Klæbende endeligering forekommer mellem to matchende DNA-fragmenter med klæbrige ender. |
| Enzymer | |
| Fræsere med stumpe ender producerer stumpe ender. | Klæbende ender giver klæbrige eller sammenhængende ender. |
| Krav om matchende ender | |
| Det kræver ikke matchende fragmenter eller komplementære baser. | Det kræver komplementære baser i enderne for at danne basepar. |
| Effektivitet | |
| Det er mindre effektivt end klæbrig endeligation | Det er mere effektivt end ligering med stump ende. |
Opsummering – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriktionsendonukleaser er i stand til at sp alte dsDNA og producere DNA-fragmenter med forskellige ender. De genkender specifikke sekvenser og begrænser DNA, hvilket skaber klæbrige og stumpe ender. Sticky ender har uparrede baser for enden af fragmenterne. Stumpe ender er skabt på grund af en lige sp altning, og de har basepar i enderne. Sticky end ligering kræver to komplementære enkeltstrengede DNA-stykker. Stumpende ligering forekommer mellem to vilkårlige to stumpende fragmenter. Dette er forskellen mellem stump og klæbrig ligering.
