Nøgleforskel – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekventering er meget vigtig for DNA-analyse, da viden om det korrekte nukleotidarrangement på en bestemt DNA-region afslører mange vigtige oplysninger om det. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Sanger-sekventering og Pyrosequencing er to forskellige DNA-sekventeringsmetoder, der er meget udbredt i molekylærbiologi. Den vigtigste forskel mellem Sanger-sekventering og Pyrosequencing er, at Sanger-sekventering bruger dideoxynucleotider til at afslutte syntesen af DNA for at læse nukleotidsekvensen, mens pyrosequencing detekterer pyrofosfatfrigivelsen ved at inkorporere nukleotiderne og syntetisere den komplementære sekvens for at læse den komplementære sekvens.
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger-sekventering er en første generations DNA-sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans colleges i 1977. Den er også kendt som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekventering, da den er baseret på kædeterminering af dideoxynucleotider (ddNTP'er). Denne metode blev meget brugt i mere end 30 år, indtil New Generation Sequencing (NGS) blev udviklet. Sanger-sekventeringsteknik muliggjorde opdagelsen af den korrekte nukleotidrækkefølge eller vedhæftning af et bestemt DNA-fragment. Den er baseret på den selektive inkorporering af ddNTP'er og terminering af DNA-syntese under in vitro DNA-replikationen. Fraværet af 3' OH-grupper til at fortsætte phosphodiesterbindingsdannelse mellem tilstødende nukleotider er et unikt træk ved ddNTP'er. Når først ddNTP'en er vedhæftet, ophører kædeforlængelsen og afsluttes fra det tidspunkt. Der er fire ddNTP'er – ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP – brugt i Sanger-sekventering. Disse nukleotider stopper DNA-replikationsprocessen, når de inkorporeres i den voksende DNA-streng og resulterer i varierende længder af kort DNA. Kapillær gelelektroforese bruges til at organisere disse korte DNA-strenge efter deres størrelser på en gel som vist i figur 01.
Figur 1: Kapillær gelelektroforese af syntetiseret kort DNA
For in vitro-replikation af DNA bør der stilles få krav. De er DNA-polymeraseenzym, template-DNA, oligonukleotidprimere og deoxynukleotider (dNTP'er). I Sanger-sekventering udføres DNA-replikation i fire separate reagensglas sammen med fire typer ddNTP'er separat. Deoxynukleotider er ikke fuldstændigt erstattet af de respektive ddNTP'er. En blanding af det bestemte dNTP (f.eks. dATP + ddATP) er inkluderet i røret og replikeres. Fire separate rørprodukter køres på en gel i fire separate brønde. Ved at læse gelen kan sekvensen konstrueres som vist i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekventering
Sanger-sekventering er en vigtig teknik, der hjælper på mange områder af molekylærbiologi. Humant genom-projekt blev gennemført med succes ved hjælp af Sanger-sekventering-baserede metoder. Sanger-sekventering er også nyttig i mål-DNA-sekventering, cancer- og genetisk sygdomsforskning, genekspressionsanalyse, menneskelig identifikation, patogendetektion, mikrobiel sekventering osv.
Der er flere ulemper ved Sanger-sekventering:
- Længden af det DNA, der sekventeres, må ikke være længere end 1000 basepar
- Kun én streng kan sekvenseres ad gangen.
- Processen er tidskrævende og dyr.
Derfor blev nye avancerede sekventeringsteknikker udviklet med tiden for at overvinde disse problemer. Sanger-sekventering er dog stadig i brug på grund af dets meget nøjagtige resultater op til ca. 850 baseparlængdefragmenter.
Hvad er Pyrosequencing?
Pyrosequencing er en ny DNA-sekventeringsteknik baseret på "sekventering ved syntese". Denne teknik er afhængig af påvisning af pyrophosphatfrigivelse ved nukleotidinkorporering. Processen anvendes af fire forskellige enzymer: DNA-polymerse, ATP-sulfurylase, luciferase og apyrase og to substrater adenosin 5'-phosphosulfat (APS) og luciferin.
Processen starter med, at primeren binder til den enkeltstrengede DNA-skabelon, og DNA-polymerase starter inkorporeringen af nukleotider, der er komplementære til den. Når nukleotiderne går sammen (nukleinsyrepolymerisation), frigiver det pyrophosphat (to fosfatgrupper bundet sammen) grupper og energi. Hver nukleotidtilsætning frigiver ækvimolær mængde pyrophosphat. Pyrophosphat omdannes til ATP ved ATP-sulfurylase i nærvær af substrat APS. Den genererede ATP driver den luciferasemedierede omdannelse af luciferin til oxyluciferin, hvilket producerer synligt lys i mængder, der er proportionale med mængden af ATP'er. Lys detekteres af en fotondetektionsenhed eller af fotomultiplikator og skaber et pyrogram. Apyrase nedbryder ATP og ikke-inkorporerede dNTP'er i reaktionsblandingen. dNTP-tilsætning udføres én gang ad gangen. Da tilføjelsen af nukleotid er kendt i henhold til inkorporering og påvisning af lys, kan sekvensen af templaten bestemmes. Pyrogram bruges til at generere nukleotidsekvensen af prøve-DNA'et som vist i figur 03.
Pyrosequencing er meget vigtig i enkeltnukleotidpolymorfianalyse og sekventering af korte DNA-strækninger. Den høje nøjagtighed, fleksibilitet, lette automatisering og parallel behandling er fordelene ved pyrosequencing frem for Sanger-sekventeringsteknikker.
Figur 03: Pyrosequencing
Hvad er forskellen mellem Sanger Sequencing og Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger-sekventering er en DNA-sekventeringsmetode baseret på selektiv inkorporering af ddNTP'er ved hjælp af DNA-polymerase og kædeterminering. | Pyrosequencing er en DNA-sekventeringsmetode baseret på påvisning af pyrophosphatfrigivelse ved inkorporering af nukleotid. |
| Brug af ddNTP | |
| ddNTP'er bruges til at afslutte DNA-replikationen | ddNTP'er bruges ikke. |
| Enzymer involveret | |
| DNA-polymerase anvendes. | Der bruges fire enzymer: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, Luciferase og Apyrase. |
| Udnyttede substrater | |
| APS og Luciferin bruges ikke. | Adenosine 5'-phosphosulfat (APS) og luciferin bruges. |
| Maksimal temperatur | |
| Dette er en langsom proces. | Dette er en hurtig proces. |
Opsummering – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekventering og Pyrosequencing er to DNA-sekventeringsmetoder, der bruges i molekylærbiologi. Sanger-sekventering konstruerer rækkefølgen af nukleotiderne i rækkefølge ved at afslutte kædeforlængelsen, mens pyrosekvenseringen konstruerer den præcise rækkefølge af nukleotiderne i rækkefølge ved at inkorporere nukleotider og detektere frigivelsen af pyrophosphater. Derfor er den største forskel mellem Sanger-sekventering og Pyrosequencing, at Sanger-sekventering fungerer på sekventering ved kædeterminering, mens pyrosequencing fungerer på sekventering ved syntese.
