Key Difference – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotider er de grundlæggende strukturelle enheder og byggesten i DNA. DNA-molekyle er sammensat af en polynukleotidkæde. Der findes fire forskellige nukleotider i DNA. Disse nukleotider er sammensat af fire forskellige nitrogenholdige baser kaldet A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (thymin). Rækkefølgen af nukleotiderne i DNA-molekylet har stor betydning, da det koder for en vigtig genetisk information for organismers vækst og udvikling. DNA-sekventering refererer til den proces, der bestemmer den præcise nukleotidsekvens af DNA'et. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Maxam Gilbert-sekventering og Sanger DNA-sekventering er to metoder til DNA-sekventering, som hører til første generations sekventering. Maxam Gilbert-sekventeringsprocedure bestemmer basesekvensen ved kemisk at sp alte de 5'-ende mærkede DNA-fragmenter fortrinsvis ved hver af fire nukleotider og gelelektroforese. Sanger-sekventeringsproceduren bestemmer nukleotidsekvensen ved at syntetisere enkeltstrenget DNA ved hjælp af DNA-polymerase og dideoxynukleotider og gelelektroforese. Dette er den vigtigste forskel mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing.
Hvad er Maxam Gilbert Sequencing?
Maxam Gilbert-sekventering, også kendt som kemisk sekventeringsmetode, er en teknik, der blev udviklet til at bestemme rækkefølgen af nukleotiderne i DNA. Denne metode blev introduceret af W alter Gilbert og Alan Maxam i 1976 og blev populær, da den kan udføres direkte med renset DNA. Maxam Gilbert-metoden hører til den første generation af DNA-sekventering, og det var den første sekventeringsmetode, der blev brugt bredt af forskere.
Det grundlæggende princip for denne metode ligger i begrænsningen af de endemærkede DNA-fragmenter ved specifikke baser ved basespecifikke kemikalier og betingelser og adskillelse af de mærkede fragmenter ved elektroforese som vist i figur 01. Fragmenter adskilles iht. til deres størrelser på gelen. Da fragmenterne er mærket, kan sekvensen af DNA-molekylet let udledes.
Maxam gilbert-metoden bruger basespecifikke kemikalier til at bryde DNA ved specifikke baser. To almindelige kemikalier ved navn dimethylsulfat og hydrazinkemikalier bruges til selektivt at angribe henholdsvis puriner og pyrimidiner.
Maxam Gilbert-sekventeringsmetoden udføres via flere trin som følger.
- Oprensning af DNA-sekvensen ved hjælp af restriktionsendonukleaser
- Mærkning af enderne af DNA-fragmenterne ved tilsætning af radioaktive fosfater
- Oprensning af de mærkede fragmenter fra ikke-mærkede fragmenter ved gelelektroforese
- Separation af det endemærkede DNA i fire rør og behandling med basespecifikke kemikalier separat
- Elektroforese af indholdet af hvert rør på separate linjer på en gel og fragmentadskillelse i henhold til deres længde.
- Detektion af fragmenterne ved autoradiograf.
Figur 01: Maxam Gilbert Sequencing
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for at bestemme basesekvensen af et givet DNA-fragment. Det er også kendt som kædetermineringssekventering eller Dideoxy-sekventeringsmetode. Denne metode fungerer efter princippet om selektiv inkorporering af kædeterminerende dideoxynukleotider (ddNTP'er) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP ved hjælp af DNA-polymerase under syntesen af enkeltstrenget DNA for at afslutte strengdannelse. Dideoxynukleotider mangler 3' OH-grupper til dannelse af phosphodiesterbindinger med tilstødende nukleotid. Derfor stopper strengdannelsen, når en ddNTP er inkorporeret i nydannende streng under sanger-sekventering.
I denne metode udføres fire separate DNA-syntesereaktioner (PCR) i fire separate rør med én type ddNTP. Der stilles også andre krav til rørene til PCR, herunder primere, dNTP'er, Taq polymerase, specifikke forhold osv. Fire separate reaktioner udføres i fire rør med fire blandinger. Efter PCR-reaktioner varmedenatureres de resulterende DNA-fragmenter og adskilles ved gelelektroforese. Derefter visualiseres fragmenterne ved at bruge enten en mærket (radioaktiv eller fluorescerende) primer eller dNTP'er som vist i figur 02.
Figur 02: Sanger Sequencing
Hvad er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sekventering er den første teknik udviklet til DNA-sekventering. | Sanger-sekventeringsmetoden blev introduceret efter Maxam Gilbert-sekventeringsmetoden. |
| Usage | |
| Denne metode bruges sjældent. | Sanger-sekventering bruges rutinemæssigt til sekventering. |
| Brug af farlige kemikalier | |
| Den bruger farlige kemikalier. | Brug af farlige kemikalier er begrænset sammenlignet med Maxam Gilbert-metoden. |
| Mærkning til detektion | |
| Denne metode bruger radioaktivt P32 til at mærke enderne af DNA-fragmenterne. | Sanger-sekventering bruger radioaktivt eller fluorescerende mærkede ddNTP'er. |
Opsummering – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert og Sanger-sekventering er to typer DNA-sekventeringsteknikker, der kommer under første generations DNA-sekventering. Maxam Gilbert-sekventering er den første metode, der blev introduceret til DNA-sekventering i 1976, og den udføres ved at bryde de endemærkede DNA-fragmenter med basespecifikke kemikalier. Derfor er det kendt som kemisk sekventering. Sanger-sekventeringsmetoden blev introduceret i 1977 og er baseret på de ddNTP-drevne kædetermineringsreaktioner. Sanger-sekventeringsmetode populær end Maxam Gilbert-metoden på grund af adskillige ulemper ved Maxam Gilbert-metoden, såsom for stort tidsforbrug, brug af farlige kemikalier osv. Dette er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger-sekventering.
