Nøgleforskel – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotid-sekventeringsteknikker, der er udviklet gennem tiden. Sanger Sequencing-metoden blev meget brugt i mange år, og NGS erstattede den for nylig på grund af dens fordele. Den vigtigste forskel mellem NGS og Sanger Sequencing er, at NGS arbejder efter princippet om at sekventere millioner af sekvenser samtidigt på en hurtig måde gennem et sekventeringssystem, mens Sanger Sequencing arbejder på princippet om kædeterminering på grund af selektiv inkorporering af dideoxynukleotider af DNA-polymeraseenzym under DNA-replikationen og resulterende fragmentseparation ved kapillærelektroforese.
Hvad er nukleotidsekvensering?
Genetisk information er lagret i nukleotidsekvenserne af en organismes DNA eller RNA. Processen med at bestemme den korrekte rækkefølge af nukleotider (ved hjælp af fire baser) i et givet fragment (i et gen, klynge af gener, kromosom og komplet genom) er kendt som nukleotidsekventering. Det er meget vigtigt i genomiske undersøgelser, retsmedicinske undersøgelser, virologi, biologisk systematik, medicinsk diagnose, bioteknologi og på mange andre områder at analysere geners struktur og funktion. Der er forskellige typer sekventeringsmetoder udviklet af forskere. Blandt dem blev Sanger-sekventering udviklet af Frederick Sanger i 1977 meget brugt og populært i en lang periode, indtil Next Generation Sequencing erstattede det.
Hvad er NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) er et udtryk, der bruges til at henvise til moderne sekventeringsprocesser med høj kapacitet. Den beskriver en række forskellige moderne sekventeringsteknologier, som revolutionerede genomiske undersøgelser og molekylærbiologi. Disse teknikker er Illumina-sekventering, Roche 454-sekventering, Ion Proton-sekventering og SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection)-sekventering. NGS-systemer er hurtigere og billigere. Fire primære DNA-sekventeringsmetoder anvendes i NGS-systemer, nemlig; pyrosequencing, sekventering ved syntese, sekventering ved ligering og ion-halvleder-sekventering. Et stort antal DNA- eller RNA-strenge (millioner af) kan sekventeres parallelt. Det tillader sekventering af hele genomet af organismer inden for en kort tidsperiode, i modsætning til Sanger-sekventering, som tager længere tid.
NGS har mange fordele i forhold til konventionel Sanger-metode. Det er en højhastigheds, mere nøjagtig og omkostningseffektiv proces, som kan udføres med en lille prøvestørrelse. NGS kan bruges i metagenomiske undersøgelser, til påvisning af variationer inden for et individuelt genom på grund af insertioner og deletioner osv. og i analyse af genekspressioner.
Figure_1: Udviklinger i NGS-sekvensering
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for at bestemme den præcise nukleotidrækkefølge for et givet DNA-fragment. Det er også kendt som kædetermineringssekventering eller Dideoxy-sekventering. Arbejdsprincippet for denne metode er terminering af strengsyntese ved selektiv inkorporering af kædeterminerende dideoxynukleotider (ddNTP'er) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP med DNA-polymerase under replikationen af DNA. Normale nukleotider har 3' OH-grupper til dannelse af en phosphodiesterbinding mellem tilstødende nukleotider for at fortsætte strengdannelsen. Imidlertid mangler ddNTP'er denne 3' OH-gruppe og er ude af stand til at danne phosphodiesterbindinger mellem nukleotider. Derfor er kædeforlængelsen ophørt.
I denne metode tjener det enkeltstrengede DNA, der skal sekventeres, som skabelonstrengen for in vitro DNA-syntese. Andre krav er oligonukleotidprimer, deoxynukleotidprækursorer og DNA-polymeraseenzym. Når de flankerende ender af målfragmentet er kendt, kan primere let designes til DNA-replikation. Fire separate DNA-syntesereaktioner udføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTP'er sammen med andre krav. Fra det bestemte nukleotid tilsættes en blanding af dNTP'er og ddNTP'er. Ligeledes udføres fire separate reaktioner i fire rør med fire blandinger. Efter reaktionerne udføres påvisning af DNA-fragmenter og konvertering af fragmentmønsteret til sekvensinformation. Resulterende DNA-fragmenter varmedenatureres og separeres ved gelelektroforese. Hvis der anvendes radioaktive nukleotider, kan båndmønsteret i polyacrylamidgelen visualiseres ved autoradiografi. Når denne metode anvender de fluorescerende mærkede dideoxynukleotider, kan den dæmpes ned i gelen aflæses og passeres gennem en laserstråle for at blive detekteret af fluorescensdetektoren. For at undgå fejl, der kan opstå, når en sekvens læses af øjet og indtastes manuelt i en computer, udviklede denne metode sig til brugen af automatiseret sequencer koblet med computeren.
Dette er den metode, der bruges til at sekventere DNA fra Human Genome-projektet. Denne metode er stadig i brug med avancerede modifikationer, fordi den giver nøjagtige sekvensoplysninger på trods af at den er en dyr og langsom proces.
Figure_2: Sanger Sequencing
Hvad er forskellen mellem NGS og Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) refererer til moderne high throughput sekventeringsprocesser. Den beskriver en række forskellige moderne sekventeringsteknologier | Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger til at bestemme den præcise nukleotidrækkefølge for et givet DNA-fragment. |
| Omkostningseffektivitet | |
| NGS er en billigere proces, fordi den reducerer tid, mandskab og kemikalier. | Dette er en dyr proces, fordi det tager tid, mandskab og flere kemikalier. |
| Speed | |
| Dette er hurtigere, da både kemisk detektering og signaldetektion af mange strenge foregår parallelt. | Dette er tidskrævende, da kemisk detektion og signaldetektion sker som to separate processer og kun på streng kan læse ad gangen. |
| Plidelighed | |
| NGS er pålidelig. | Sanger-sekventering er mindre pålidelig |
| Eksempelstørrelse | |
| NGS kræver mindre mængde DNA. | Denne metode kræver en stor mængde skabelon-DNA. |
| DNA-baser pr. sekventeret fragment | |
| Antallet af DNA-baser pr. sekventeret fragment er lavere end Sanger-metoden | Genererende sekvenser er længere end NGS-sekvenser. |
Opsummering – NGS vs Sanger Sequencing
NGS og Sanger-sekventering er nukleotid-sekventeringsteknikker, der i vid udstrækning anvendes i molekylærbiologi. Sanger-sekventering er en tidlig sekventeringsmetode, som blev erstattet af NGS. Den største forskel mellem NGS og Sanger Sequencing er, at NGS er en højhastigheds, mere nøjagtig og omkostningseffektiv proces end Sanger-sekventering. Begge teknikker skabte store udbrud inden for genetik og bioteknologi.
