Nøgleforskel – T4 vs T7 DNA Ligase
DNA-ligase er et vigtigt enzym, der bruges i molekylærbiologiske teknikker. Det fungerer som en molekylær lim til at forbinde nukleotider ved at danne phosphodiesterbindinger mellem nukleotider. Phosphodiesterbindingerne dannes mellem 3'-hydroxyl-enden af sukkerdelen og 5'-ende-phosphatgruppen. DNA-ligase er afgørende i replikationsprocessen for at forbinde Okazaki-fragmenterne af den efterslæbende streng og under DNA-reparationsmekanismer og in vitro kloningseksperimenter for at forbinde det ønskede gen af interesse til vektorgenomet. Der er to vigtigste DNA-ligaser, der i øjeblikket bruges af molekylærbiologer: T4 og T7 DNA-ligaser. T4 DNA-ligase er et af de første enzymer, der blev isoleret fra T4-bakteriofagen. T7 DNA ligase, som er et mindre protein, er et enzym isoleret fra T7 bakteriofag. Dette er den vigtigste forskel mellem T4 og T7 DNA-ligaser.
Hvad er virkningen af DNA-ligase?
DNA-ligering sker i en tre-trins reaktion. Det første trin er et nukleofilt angreb på alfa-phosphor af ATP, der genererer et kovalent enzym-adenylat-mellemprodukt, hvor AMP er bundet til det terminale sidekædenitrogen i lysin. I det andet trin sker der et nukleofilt angreb på enzymadenylatets fosfor af det 5'-phosphatterminerede DNA-substrat, hvorved lysin frigives og DNA-adenylat dannes. I det sidste trin angribes DNA-adenylat af 3'- OH af en anden DNA-streng, frigiver AMP og forbinder polynukleotiderne.
Hvad er T4 DNA-ligase?
T4 Ligase var den første ligase, der blev isoleret og identificeret af Meselson, Weigle og Kellenberger og var den første nogensinde producerede kommercielle ligase. T4 DNA-ligase er et ATP-afhængigt enzym, som katalyserer fosfodiesterbindingsdannelsen. Det er en enkelt polypeptidkæde med 487 aminosyrerester og har en molekylvægt på ca. 77 kDa. Den optimale pH for dets aktivitet ligger i området 7,5 – 8,
Figur 01: T4 DNA Ligase
T4 DNA Ligase, som navnet antyder, er til stede i bakteriofag T4 og blev isoleret, da fag producerede enzymet efter infektion med E. coli. Enzymet ligerer dobbeltstrengede DNA-duplekser med stumpe ender, og de fragmenter, der skal bindes, skal være tæt på hinanden.
Hvad er T7 DNA-ligase?
T7-ligase er 41 kDa-protein produceret af T7 Bacteriophage og isoleres ved at inficere E. coli-celler. Hovedfunktionen af T7-ligase er at ligere DNA-duplekser gennem phosphodiester-bindinger og forbinde nærliggende fragmenter af DNA under kloningseksperimenter. Den optimale pH for T7 DNA-ligase ligger i området 7,0 – 7,2. T7-ligase er ATP-afhængig. T7 DNA-ligaser er også i stand til at anneale DNA- og RNA-hybrider, hvilket giver anledning til unormale konformationer under transkription; men dette fænomen er stadig under forskning i in vitro undersøgelser.
Hvad er lighederne mellem T4 og T7 DNA Ligase?
- T4 og T7 DNA Ligase deltager i en ligeringsreaktion ved at anneale DNA-duplekser gennem phosphodiesterbindingsdannelse mellem 3' OH-enden og 5'-phosphatenden af DNA-fragmentet.
- Begge enzymer ligerer stumpe DNA-duplekser, som er tæt på hinanden.
- Begge enzymer er ATP-afhængige.
- Disse enzymer isoleres ved at inficere E. coli-celler med den særlige bakteriofag.
- Anvendelser af begge enzymer omfatter:
- Molekylær kloning – for at ligere genet af interesse til vektoren
- DNA-reparation – til reparation af dobbeltstrengede nicher
- In vitro DNA-replikation
- Ligase-kædereaktion
Hvad er forskellen mellem T4 og T7 DNA Ligase?
T4 vs T7 DNA Ligase |
|
| T4 DNA Ligase-type af DNA-ligase isoleret fra bakteriofag T4 og er involveret i ligering af tilstødende DNA-fragmenter via phosphodiesterbindingsdannelse. | T7 DNA Ligase-type af DNA-ligase isoleret fra bakteriofagen T7 og er involveret i ligering af tilstødende DNA-fragmenter via phosphodiesterbindingsdannelse. |
| Størrelse på protein | |
| Størrelsen af T4 DNA-ligase er 77 kDa – større sammenlignet med T7 DNA-ligase. | Størrelsen af T7 DNA-ligase er 41 kDa. |
| Optimal pH | |
| pH-område, der virker T4 DNA-ligase, er 7,5 – 8,0. | pH-område, der virker T7 DNA-ligase, er 7,0 – 7,2. |
Oversigt – T4 vs T7 DNA Ligase
DNA-ligaser er en vigtig klasse af enzymer, der er involveret i molekylær kloning for at producere rekombinante DNA-molekyler, der indeholder genet af interesse. Ligeringsreaktion er en energiudnyttende reaktion, og der er nye forskningsundersøgelser i gang for at forbedre nøjagtigheden ved at modulere de tilgængelige ligaser. T4 og T7 DNA-ligaser er to typer vigtige DNA-ligaseenzymer, der bruges i molekylærbiologiske teknikker. T7 DNA-ligase er også et resultat af forskning, som var baseret på den primære ligase isoleret fra T4-inficerede E. coli. T7 er skildret mere effektivitet og nøjagtighed i udførelsen af sin funktion på grund af dens mindre størrelse. Dette er forskellen mellem T4 og T7 ligase.
Download PDF-version af T4 vs T7 DNA Ligase
Du kan downloade PDF-versionen af denne artikel og bruge den til offline-formål i henhold til citatnoter. Download venligst PDF-versionen her Forskel mellem T4 og T7 Ligase.
