Nøgleforskellen mellem klon for klon sekvensering og shotgun sekvensering ligger i deres adfærdsmetode. Klon-for-klon-sekventeringsmetode involverer kortlægning af kromosomer og kloning før sekventering, mens klon med haglgevær-sekventering udelader både kromosomkortlægning og kloningstrin under sekventeringen.
Klon ved klon-sekventering og klon ved shotgun-sekventering er to metoder til moderne genom-sekventering. Klon for klon sekventering er en mere pålidelig metode til sekventering. Metoden til kloning ved haglgeværsekventering er dog hurtigere og billigere. Artiklen fokuserer på den subtile forskel mellem klon for klon sekvensering og haglgevær sekvensering.
Hvad er Clone by Clone Sequencing?
Klon ved klon-sekventering er en metode til genomsekventering. Det kræver kortlægning af hvert kromosom før DNA-opdeling. Efter kortlægningen skal DNA'et nedbrydes i fragmenter på 150 kilobaser lange. Disse fragmenter er derefter klar til sekventering. Næste trin er indsættelse af DNA-fragmenter i bakterielle kunstige kromosomer (BAC'er) og derefter i bakterieceller. Da fragmenterne nu er inde i bakteriecellerne, deler de indsatte DNA-fragmenter sig hver gang, når bakterierne deler sig, og producerer mange identiske kopier. Derefter fragmenteres det individuelle bakterielle klon-DNA til 500 basepar lange fragmenter. De er mindre og overlappende fragmenter. Dernæst finder sekventeringen sted med indsættelse af disse fragmenter i en vektor med en kendt DNA-sekvens. Startende fra den kendte sekvens af vektoren, fortsætter sekventering op til ukendt sekvens.
Efter endt sekvensering er det nødvendigt at identificere områderne med overlappende sekvenser. Derefter finder sammenføjning af fragmenterne sted for at danne de større fragmenter, der oprindeligt præsenteres i BAC'er. Dernæst foregår samlingen af større fragmenter i kromosomet i henhold til genomkortet.
Figur 01: Klon efter klonsekvens
Den væsentlige fordel ved klon-for-klon-sekventering er, at det præ-forberedte genomkort hjælper en pålidelig samling af større fragmenter. Men ulempen ved denne sekventeringsmetode er, at det er tidskrævende at generere genomkort og lave kloner. Dette var imidlertid den foretrukne metode under 'Human Genome Project'.
Hvad er Clone by Shotgun Sequencing?
Klon ved shotgun-sekventering er en sekventeringsmetode, som tilfældigt opdeler DNA-sekvenser i mange små fragmenter og samler sekvensen igen ved at observere de overlappende områder. Større pattedyrsgenomer er vanskelige at klone sekvens og samle. Det skyldes deres strukturelle kompleksitet og størrelse. Selvom klon for klon sekventeringsmetoden er pålidelig, tager det lang tid at sekventere genomer af komplekse organismer. Derfor er clone by shotgun sekventering blevet en pålidelig billigere sekventeringsmetode, der kan udføres hurtigere. Derfor stoler nutidens videnskabsmænd på denne sekventeringsmetode til at tackle komplekse genomer.
Figur 02: Klon ved shotgun-sekvensering
Under kloning med haglgevær-sekventeringsmetode finder der ingen konventionel genomkortlægning og kloningstrin sted. I første omgang er hele genomet fragmenteret i varierende størrelser fra 20 kilobaser til 300 kilobaser. Dernæst finder sekventering sted. Så ved at bruge sofistikeret computersoftware er det nødvendigt at samle fragmenterne ved at se på de overlappende områder.
Klon ved shotgun-sekventering hjælper med at forbedre nøjagtigheden af eksisterende genomsekvenser. Den største fordel ved denne metode er, at den er meget hurtigere og billigere end klon for klon sekventeringsmetode. Denne proces involverer dog ikke brugen af et genetisk kort. Derfor er der større sandsynlighed for, at der opstår fejl under samlingen. Dette er således en stor ulempe ved kloning med haglgevær-sekventeringsmetode.
Hvad er lighederne mellem Clone by Clone Sequencing og Shotgun Sequencing?
- Både klon-for-klon-sekventering og haglgevær-sekventering er to metoder til genom-sekventering.
- Under begge sekventeringsteknikker finder samling af nedbrudte fragmenter sted ved at identificere overlappede områder.
- Også er nedbrydning af DNA i mindre fragmenter nødvendig for både klon- og haglgeværsekventering.
Hvad er forskellen mellem Clone by Clone Sequencing og Shotgun Sequencing?
Klon for klon-sekventeringsteknik involverer to hovedtrin: kortlægning af kromosomer og kloning. I modsætning hertil følger klon ved haglgevær-sekventering ikke disse to trin; det opdeler tilfældigt DNA-sekvenser i mange små fragmenter og samler sekvensen igen ved at observere de overlappende områder. Derfor er dette den vigtigste forskel mellem klon for klon sekvensering og haglgevær sekvensering. På grund af denne faktor er klon for klon sekventering en dyr og tidskrævende proces, mens klon ved shotgun sekvensering er hurtigere og billigere.
Fejl under samling er imidlertid mindre tilbøjelige til at opstå under klon-for-klon-sekventering. Derfor har den høj pålidelighed. Klon ved haglgevær-sekventering er imidlertid en forholdsvis mindre pålidelig teknik. Så dette er også en væsentlig forskel mellem klon for klon sekvensering og shotgun sekvensering.
Nedenstående info-grafik præsenterer flere oplysninger om forskellen mellem klon for klon sekvensering og shotgun sekvensering.
Oversigt – Klon efter klonsekvens vs haglgeværsekvens
I opsummering af forskellen mellem klon-for-klon-sekventering og haglgevær-sekventering, er klon-for-klon-sekventering og haglgevær-sekventering to metoder til genom-sekventering. Klon for klon-sekventeringsteknik involverer imidlertid både genomkortlægning og kloningsprocesser, mens klon ved shotgun-sekventering ikke gør det. Så dette er den vigtigste forskel mellem klon for klon sekvensering og haglgevær sekvensering. Da genomkortlægning finder sted under klon-for-klon-sekventering, er der mindre sandsynlighed for, at fejl opstår under samlingen af sekvenser. Men clone by shotgun sekventering er en meget hurtigere og billigere proces. Alligevel er den forholdsvis mindre pålidelig. Klon for klon sekventering var den foretrukne sekventeringsmetode under 'Human Genome Project'. Men nutidens molekylærbiolog er mere afhængig af klon ved shotgun-sekvensering.
