Nøgleforskel – papir vs tyndt lag vs kolonnekromatografi
Papirkromatografi, tyndtlagskromatografi og søjlekromatografi er tre typer kromatografiske teknikker. Nøgleforskellen mellem papirkromatografi, tyndtlagskromatografi og søjlekromatografi er baseret på typen af stationær fase, der bruges i kromatografiteknikken. Papirkromatografi bruger et cellulosepapir som sin stationære fase, tyndlagskromatografi bruger aluminiumoxid eller silicagel som sin stationære fase, hvorimod kolonnekromatografi bruger en søjle pakket med et passende matrixmateriale som sin stationære fase.
I processen med adskillelse og identifikation af biomolekyler, såsom proteiner og kulhydrater, er kromatografi en vigtig biofysisk teknik, der anvendes. Kromatografi adskiller forbindelser baseret på deres opløselighed, størrelse og ladning. Baseret på separationsmekanismen bruger kromatografi mekanismer som ionbytning, absorption, fordeling og størrelsesudelukkelse, og der er tre kromatografiske teknikker; nemlig papir-, tyndtlags- og søjlekromatografi. Papirkromatografi er baseret på faststof-væske-adsorption og opløselighed af forbindelsen, og den bruger et cellulosepapir som den stationære fase. Tyndtlagskromatografi er baseret på faststof-væske-adsorption af molekyler. Den har en stationær fase, der typisk er lavet af aluminiumoxid eller silicagel, og den mobile fase, der er opløsningsmidlet. Søjlekromatografi bruger en søjle pakket med en matrix, der bruges til at adskille molekyler hovedsageligt baseret på deres størrelse, affinitet eller dets ladning.
Hvad er papirkromatografi?
Papirkromatografi er den enkleste type kromatografi, der bruges, og den bruges ikke til omfattende forskning. Det bruges hovedsageligt i studenterlaboratorier til at identificere biomolekyler såsom aminosyrer og kulhydrater til stede i blandinger. Papirkromatografi bruger en stationær fase, der er fremstillet ved hjælp af cellulosepapir eller Whatman-filterpapir, og en mobil fase, der norm alt fremstilles ved hjælp af organiske opløsningsmidler såsom n-butanol osv. Den stationære fase er mættet med vand, hvilket gør den stationære fase flydende. Når forbindelserne således pletteres og får lov at løbe i nærværelse af den mobile fase, afhængigt af forbindelsernes opløselighed, adskilles de. Efter udviklingen af kromatogrammet kan farvning således udføres for at bestemme forløbets længde af hver forbindelse. Retentionsfaktoren kan derved beregnes.
Figur 01: Papirkromatografi
Papirkromatografi kan yderligere klassificeres som stigende papirkromatografi og faldende papirkromatografi afhængigt af retningen af det løbende opløsningsmiddel.
Hvad er tyndlagskromatografi?
Tyndtlagskromatografi eller TLC er en almindeligt anvendt teknik til at identificere forskellige aminosyrer til stede i en blanding eller til identifikation af proteiner. Teknikken til separation er baseret på faststof-væske adsorption. Under tyndtlagskromatografi bruges en plade lavet af aluminiumoxid eller silicagel som stationær fase. Opløsningsmiddelblandingen varierer efter behov og kan anvende forskellige kombinationer af organiske forbindelser såsom n-butanol, eddikesyre og vand til at fremstille opløsningsmidlet. Forbindelserne, der skal adskilles, pletteres på pladen og nedsænkes i opløsningsmiddelblandingen. Når først opløsningsmidlet bevæger sig op baseret på kapillærvirkningen givet af pladen, bevæger forbindelserne plettet på pladen sig også afhængigt af deres opløselighed i opløsningsmidlet.
Figur 02: Tyndtlagskromatografi
Detektionen af pletterne efter kromatogrammet udføres ved forskellige farvningsprocedurer. Nogle bruger ninhydrinfarvning, der er en ret giftig metode til farvning. Moderne tyndtlagskromatogrammer bruger fluorescensteknikker til at se kromatogrammet efter kørslen. Afhængigt af de afstande, den har tilbagelagt, kan retentionstiden for hver forbindelse beregnes. Dette kan bruges til at identificere typen af forbindelse separeret baseret på den anvendte blanding. TLC bruges hovedsageligt til at identificere aminosyrer i en proteinblanding og også til at adskille forskellige typer monosaccharider, der findes i en blanding.
Hvad er kolonnekromatografi?
Søjlekromatografi er et bredt begreb, der bruges til at beskrive mange typer kromatografiteknikker, der bruger den kolonnebaserede separationsmetode. Ved søjlekromatografi bruges en fysisk søjle med et pakningsmateriale til at adskille forbindelserne. Adskillelsen kan være baseret på forskellige fysiske egenskaber udvist af forbindelserne. Disse egenskaber kan være ladningen, størrelsen, 3D-konformationen og bindingskapaciteten osv. Således fungerer søjlen pakket med matrixmaterialet som den stationære fase, og vaskebufferen påført søjlen fungerer som den mobile fase.
Hvis molekylerne adskilles baseret på størrelsen, pakkes pakningsmaterialet på en måde, så det efterlader porer, som forbindelserne kan rejse igennem. Således elueres de større molekyler, der ikke kan strømme gennem porerne, først, hvorimod de mindre molekyler tager meget længere tid at eluere.
Figur 03: Kolonnekromatografi
Hvis molekylerne adskilles baseret på deres ladning, vil den stationære fase indeholde enten en anion- eller kationbytter, som forbindelserne vil blive tiltrukket af baseret på deres ladning. Under vasketrinnet vil de ikke-bundne forbindelser således blive elueret. Efter tilsætning af elueringsbufferen vil de bundne ladede forbindelser blive elueret. Påvisningen af disse eluenter er for det meste baseret på spektrofotometriske teknikker.
Hvad er lighederne mellem papirtyndt lag og søjlekromatografi?
- All Paper Thin Layer and Column Chromatography tre teknikker bruges til adskillelse af biomolekyler såsom aminosyrer, proteiner og kulhydrater.
- Papirtyndtlags- og søjlekromatografiteknikker har en mobil fase og en stationær fase.
- Papirtyndtlags- og søjlekromatografiteknikker bruger biofysiske mekanismer til adskillelse.
Hvad er forskellen mellem papirtyndt lag og søjlekromatografi?
Papir vs Thin Layer vs Column Chromatography |
|
| Papirkromatografi | Papirkromatografi er en kromatografisk teknik, der bruges til at adskille forbindelser baseret på væske-væske-adsorption og opløselighed af forbindelsen. Den bruger et cellulosepapir som sin stationære fase. |
| tyndtlagskromatografi | Tyndlagskromatografi er en anden kromatografisk teknik baseret på faststof-væske-adsorption af molekyler. Den har en stationær fase lavet af aluminiumoxid eller silicagel og et opløsningsmiddel som den mobile fase, som er opløsningsmidlet. |
| Kolonnekromatografi | Søjlekromatografi bruger en søjle pakket med en matrix, der bruges til at adskille molekyler hovedsageligt baseret på deres størrelse, affinitet eller dets ladning. |
| Stationær fase | |
| Papirkromatografi | Papir lavet af nitrocellulose fra Whatman bruges som den stationære fase i papirkromatografi. |
| tyndtlagskromatografi | Aluminiumoxid eller silicagel bruges som den stationære fase af tyndtlagskromatografien. |
| Kolonnekromatografi | En søjle pakket med passende pakkemateriale anvendes som stationær fase i søjlekromatografien. |
| Mobilfase | |
| Papirkromatografi | Løbende opløsningsmiddel er den mobile fase af papirkromatografien. |
| tyndtlagskromatografi | Løbende opløsningsmiddel er den mobile fase af tyndtlagskromatografien. |
| Kolonnekromatografi | Vaskebuffer er den mobile fase af søjlekromatografien. |
| Mekanismer, der bruges til adskillelse | |
| Papirkromatografi | Papirkromatografi er baseret på faststof-væske-absorption. |
| tyndtlagskromatografi | Tyndtlagskromatografi er baseret på faststof-væske-absorption. |
| Kolonnekromatografi | Søjlekromatografi er baseret på størrelsesudelukkelse, ladning og form. |
| Elutionsbuffer | |
| Papirkromatografi | Ikke påkrævet ved papirkromatografi. |
| tyndtlagskromatografi | Ikke påkrævet til tyndtlagskromatografi. |
| Kolonnekromatografi | Påkrævet i kolonnekromatografi. |
| Detection | |
| Papirkromatografi | Farvning og ved at bestemme retentionsfaktoren. |
| tyndtlagskromatografi | Farvning og ved at bestemme retentionsfaktoren. |
| Kolonnekromatografi | Spektrofotometrisk bestemmelse. |
Opsummering – Tyndt papir vs kolonnekromatografi
Papirkromatografi, TLC og søjlekromatografi er separationsteknikker, der bruges til at adskille biomolekyler såsom proteiner, aminosyrer og kulhydrater (hovedsageligt monosaccharider). Papirkromatografi bruger et cellulosepapir som den stationære fase, og separationsmekanismen er baseret på faststof-væske-adsorption. TLC bruger også faststof-væske adsorptionsmekanismer. Molekylerne er adskilt på den stationære fase, afhængig af deres opløselighed i den mobile fase. Søjlekromatografi bruger fysiske egenskaber såsom størrelse, form, ladning og molekylvægten af forbindelsen til at adskille. Søjlen pakket med matrixmaterialet fungerer som den stationære fase, hvorimod vaskebufferen fungerer som opløsningsmiddelfasen. Dette er forskellen mellem et papirtyndt lag og søjlekromatografi.
