Nøgleforskel – Microarray vs RNA-sekvensering
Transkriptom repræsenterer hele indholdet af RNA, der er til stede i en celle, herunder mRNA, rRNA, tRNA, nedbrudt RNA og ikke-nedbrudt RNA. Profilering af transkriptom er en vigtig proces for at forstå celleindsigten. Der er flere avancerede metoder til transkriptomprofilering. Microarray og RNA-sekventering er to typer teknologier udviklet til at analysere transkriptom. Den vigtigste forskel mellem mikroarray og RNA-sekventering er, at mikroarray er baseret på hybridiseringspotentialet af prædesignede mærkede prober med mål-cDNA-sekvenser, mens RNA-sekventering er baseret på direkte sekventering af cDNA-strenge ved avancerede sekventeringsteknikker såsom NGS. Microarray udføres med forudgående viden om sekvenserne, og RNA-sekventering udføres uden forudgående viden om sekvenser.
Hvad er Microarray?
Microarray er en robust, pålidelig og høj gennemløbsmetode, der bruges til transkriptomprofilering af forskere. Det er den mest populære tilgang til transskriptionsanalyse. Det er en billig metode, som afhænger af hybridiseringsproberne.
Teknikken starter med ekstraktion af mRNA fra prøven og konstruktion af cDNA-bibliotek fra tot alt RNA. Derefter blandes det med fluorescensmærkede prædesignede prober på en fast overflade (pletmatrix). Komplementære sekvenser hybridiserer med de mærkede prober i mikroarrayet. Derefter vaskes og screenes mikroarray, og billedet kvantificeres. Indsamlede data bør analyseres for at få de relative udtryksprofiler.
Intensiteten af mikroarray-proberne antages at være proportional med mængden af transskriptioner i prøven. Imidlertid afhænger teknikkens nøjagtighed af de designede prober, forudgående viden om sekvensen og affiniteten af prober til hybridisering. Derfor har mikroarray-teknologi begrænsninger. Microarray-teknik kan ikke udføres med lav-abundance-transskriptioner. Den formår ikke at differentiere isoformer og identificere genetiske varianter. Da denne metode afhænger af hybridisering af prober, forekommer nogle problemer relateret til hybridisering såsom krydshybridisering, uspecifik hybridisering osv. i mikroarray-teknik.
Figur 01: Microarray
Hvad er RNA-sekventering?
RNA-shotgun-sekventering (RNA-seq) er en nyligt udviklet hel transkriptom-sekventeringsteknik. Det er en hurtig og høj gennemløbsmetode til transkriptomprofilering. Det kvantificerer direkte ekspressionen af gener og resulterer i dyb undersøgelse af transkriptomet. RNA-seq afhænger ikke af foruddesignede prober eller forudgående viden om sekvenserne. Derfor har RNA seq-metoden høj følsomhed og evne til at detektere nye gener og genetiske varianter.
RNA-sekventeringsmetode udføres via flere trin. Tot alt RNA af cellen skal isoleres og fragmenteres. Derefter skal der ved anvendelse af revers transkriptase fremstilles et cDNA-bibliotek. Hver cDNA-streng skal ligeres med adaptere. Derefter skal de ligerede fragmenter amplificeres og oprenses. Til sidst skal der udføres sekventering af cDNA'et med en NGS-metode.
Figur 02: RNA-sekventering
Hvad er forskellen mellem Microarray- og RNA-sekventering?
Microarray vs RNA-sekvensering |
|
| Microarray er en robust, pålidelig metode med høj kapacitet. | RNA-sekventering er en nøjagtig metode med høj gennemstrømning. |
| Pris | |
| Dette er en billig metode. | Dette er en dyr metode. |
| Analyse af et stort antal prøver | |
| Dette gør det lettere at analysere et stort antal prøver samtidigt. | Dette letter analyse af et stort antal prøver. |
| Dataanalyse | |
| Dataanalyse er kompleks. | Flere data genereres i denne metode; derfor er processen mere kompleks. |
| Forudgående kendskab til sekvenser | |
| Denne metode er baseret på hybridiseringsprober, så forudgående viden om sekvenser er påkrævet. | Denne metode afhænger ikke af den forudgående sekvensviden. |
| Strukturelle variationer og nye gener | |
| Denne metode kan ikke detektere strukturelle variationer og nye gener. | Denne metode kan detektere strukturelle variationer såsom genfusion, alternativ splejsning og nye gener. |
| Følsomhed | |
| Dette kan ikke registrere forskelle i ekspression af isoformer, så dette har begrænset følsomhed. | Dette har høj følsomhed. |
| Resultat | |
| Dette kan kun resultere i relative udtryksniveauer. Dette giver ikke absolut kvantificering af genekspression. | Det giver absolutte og relative udtryksniveauer. |
| Data-genanalyse | |
| Dette skal køres igen for at genanalysere. | Sekvenseringsdata kan genanalyseres. |
| Behov for specifikt personale og infrastruktur | |
| Specifik infrastruktur og personale er ikke påkrævet til mikroarray. | Specifik infrastruktur og personale påkrævet af RNA-sekventering. |
| tekniske problemer | |
| Microarray-teknik har tekniske problemer såsom krydshybridisering, uspecifik hybridisering, begrænset detektionshastighed af individuelle prober osv. | RNA seq-teknik undgår tekniske problemer såsom krydshybridisering, uspecifik hybridisering, begrænset detektionshastighed af individuelle prober osv. |
| Biases | |
| Dette er en forudindtaget metode, da den afhænger af hybridisering. | Bias er lav sammenlignet med mikroarray. |
Oversigt – Microarray vs RNA-sekvensering
Microarray- og RNA-sekventeringsmetoder er højkapacitetsplatforme udviklet til transkriptomprofilering. Begge metoder producerer resultater, som er stærkt korrelerede til genekspressionsprofiler. Imidlertid har RNA-sekventering fordele i forhold til mikroarray til genekspressionsanalyse. RNA-sekventering er en mere følsom metode til påvisning af transkripter med lav abundance end mikroarray. RNA-sekventering muliggør også differentiering mellem isoformer og identifikation af genvarianter. Imidlertid er mikroarray det almindelige valg for de fleste forskere, da RNA-sekventering er en ny og dyr teknik med datalagringsudfordringer og kompleks dataanalyse.
