Nøgleforskellen mellem kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er, at kromatofokusering er en type søjlekromatografimetode, der anvender ionbytterharpikser, mens isoelektrisk fokusering er en type elektroforeseteknik, der anvender immobiliserede pH-gradientgeler.
Kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er to teknikker, der adskiller proteiner efter deres isoelektriske punkter. Både kromatofokusering og isoelektrisk fokusering har stor opløsningsevne. Kromatofokusering er en højopløsningssøjlekromatografimetode, mens isoelektrisk fokusering er en elektroforetisk separationsmetode. Desuden bruger kromatofokusering ikke et elektrisk felt, mens isoelektrisk fokusering kræver et elektrisk felt.
Hvad er kromatofokusering?
Kromatofokusering er en type højelueringskromatografi, der adskiller proteiner i henhold til forskelle i deres isoelektriske punkt. Den bruger en ionbytterharpikssøjle og en internt udviklet pH-gradient. I modsætning til isoelektrisk fokusering involverer kromatofokusering ikke et elektrisk felt. Kromatofokusering er en kraftfuld oprensningsteknik, som kan opløse meget lignende molekyler, selv kun afvigende med 0,02 pH-enheder. Derfor er kromatofokusering bedst egnet som et sidste poleringstrin, når der kræves høj opløsning til at adskille meget ens komponenter.
Ved kromatofokusering påføres prøven på søjlen ved at blande den med startbufferen. Proteiner, der har en pH-værdi over deres isoelektriske punkt, er negativt ladede, og de forbliver tæt på toppen af søjlen, mens andre proteiner, der er ved pH-værdien under deres isoelektriske punkt, migrerer ned ad søjlen. Proteinet med det højeste isoelektriske punkt elueres først, mens proteinet med det laveste isoelektriske punkt elueres sidst fra søjlen. Denne teknik påvirkes af flere faktorer såsom proteinudfældning og linearitet af pH-gradienten.
Hvad er isoelektrisk fokusering?
Isoelektrisk fokusering er en teknik, der adskiller forskellige molekyler baseret på deres isoelektriske punkt. Det er også kendt som elektrofokusering. Denne teknik bruges ofte til proteinadskillelse i en gel. Ved isoelektrisk fokusering tilsættes prøven til immobiliserede pH-gradient (IPG) geler. IPG gel er en akrylamidgelmatrix copolymeriseret med en pH-gradient. Proteinerne migrerer mod katoden, indtil de finder pH-området for deres isoelektriske punkter. Når et protein når pH, som ikke har nogen nettoladning, ophører migration og giver et stationært bånd. På samme måde giver hvert protein et bånd i et punkt i pH-gradienten, der svarer til dets isoelektriske punkt.
Figur 01: Isoelektrisk fokusering
Isoelektrisk fokusering er det første trin i todimensionel gelelektroforese. I den teknik separeres proteiner først i henhold til deres isoelektriske punkter ved isoelektrisk fokusering og adskilles derefter ved deres molekylvægt gennem SDS-PAGE.
Hvad er lighederne mellem kromatofokusering og isoelektrisk fokusering?
- Kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er to meget opløselige metoder.
- Begge er baseret på det isoelektriske punkt af proteiner.
- Disse teknikker bruger en pH-gradient.
- Begge procedurer er informative til karakterisering af humane hæmoglobinvarianter.
- De kan opløse molekyler, hvor pI-værdier afviger med så lidt som 0,02 pH-enheder.
Hvad er forskellen mellem kromatofokusering og isoelektrisk fokusering?
Kromatofokusering er en højopløsningssøjlekromatografiteknik, der adskiller proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt. I modsætning hertil er isoelektrisk fokusering en elektroforetisk teknik, som adskiller proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved påføring af et elektrisk felt langs en pH-gradient dannet i en kapillar. Så dette er den vigtigste forskel mellem kromatofokusering og isoelektrisk fokusering.
En anden forskel mellem kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er, at kromatofokusering ikke involverer et elektrisk felt, mens isoelektrisk fokusering kræver et elektrisk felt.
Opsummering – kromatofokusering vs isoelektrisk fokusering
Kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er to lignende teknikker, som har høj opløsningsevne hos molekyler, især meget lignende molekyler. Kromatofokusering er en højopløsningssøjlekromatografiteknik, mens isoelektrisk fokusering er en elektroforesemetode. Kromatofokusering involverer ikke et elektrisk felt, i modsætning til isoelektrisk fokusering. Dette opsummerer således forskellen mellem kromatofokusering og isoelektrisk fokusering.
