Nøgleforskellen mellem Golden Gate og Gibson Assembly er, at Golden Gate er afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder inden for en bestemt sekvens, der skal klones, mens Gibson Assembly ikke er afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder inden for en bestemt sekvens for at blive klonet.
I løbet af de sidste årtier har molekylærforskere udviklet forskellige standardiserede procedurer, der gør det lettere at samle flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke. Derfor er kloningsmetoder som Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly og TOPO Cloning meget brugt af forskere i videnskabelige eksperimenter. Derfor er Golden Gate og Gibson Assembly to molekylære kloningsmetoder, der tillader samling af flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke.
Hvad er Golden Gate Assembly?
Golden Gate er en molekylær kloningsmetode, der letter samlingen af flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke. Denne metode er afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder i en bestemt sekvens, der skal klones. Den opstod i 1996. Denne teknik bruger Type IIS restriktionsenzymer og T4 DNA ligase. Disse enzymer skærer DNA uden for genkendelsesstederne. De kan skabe ikke-palindromiske udhæng. Derfor kan flere fragmenter af DNA samles ved brug af kombinationer af overhængssekvenser.
Figur 01: Golden Gate
Golden Gate-samlingsprocedure
Golden Gate-teknikken har tre hovedtrin i sin procedure:
- oprettelse af udhæng i kloningsvektoren,
- samling af flere DNA-inserts ved at bruge fragmentspecifikke sekvenser i overhæng, og
- ligation.
Golden Gate-samling bruger cirkulære kloningsvektorer (destinationsvektor). Endvidere elimineres restriktionsstedet i denne fremgangsmåde fra det ligerede produkt for at udføre fordøjelse og ligering samtidigt. En typisk termisk cyklusprotokol for Golden Gate svinger mellem 37 °C og 16 °C, fordi 37 °C er optim alt for restriktionsenzymer og 16 °C er optim alt for ligaser.
Hvad er Gibson Assembly?
Gibson Assembly er en molekylær kloningsmetode, der tillader samling af flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke. I modsætning til Golden Gate-metoden er denne metode ikke afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder i en bestemt sekvens, der skal klones. Det blev fundet af Daniel G. Gibson fra J. Craig Venter Institute. Denne teknik er en type sekvens- og ligase-uafhængig kloningsmetode (SLIC).
Figur 02: Gibson Assembly
Gibson-samlingsprocedure
Gibson Assembly har brug for DNA-fragmenter, der indeholder 20-40 basepar, der overlapper med tilstødende DNA-fragmenter. Overlap tilføjes via PCR. Derefter tilføjes disse DNA-fragmenter til Gibson-maserblandingen, der har tre enzymer. Denne procedure udføres under isotermiske betingelser (50 °C i 1 time) under anvendelse af tre forskellige enzymer: exonuklease, DNA-polymerase og DNA-ligase. Exonukleasen tygger DNA tilbage fra 5'-enden. Det hæmmer således ikke polymeraseaktivitet og tillader reaktionen at forløbe i en enkelt proces. De resulterende enkeltstrengede regioner på tilstødende DNA-fragmenter kan anneales på grund af overlapningssekvenser. DNA-polymerase udfylder hullerne ved at tilføje nukleotider. Endelig forbinder DNA-ligasen kovalent DNA'et fra tilstødende segmenter. Norm alt bruger Gibson Assembly lineariserede destinationsvektorer. Desuden kan denne metode samtidigt kombinere op til 15 DNA-fragmenter baseret på sekvenslighed.
Ligheder mellem Golden Gate og Gibson Assembly
- Golden Gate og Gibson Assembly er to molekylære kloningsmetoder.
- Begge metoder kan samle flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke.
- Disse metoder bruger destinationsvektorer.
- Begge metoder anvender termiske cyklere til samling af flere DNA-fragmenter.
- De bruges til stedstyret mutagenese.
Forskellen mellem Golden Gate og Gibson Assembly
Golden Gate er en molekylær kloningsmetode, der anvendes til samling af flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke, der er afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder i en bestemt sekvens, der skal klones, mens Gibson Assembly er en molekylær kloningsmetode, der anvendes i samling af flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke uden at stole på tilstedeværelsen af restriktionssteder i en bestemt sekvens, der skal klones. Dette er den vigtigste forskel mellem Golden Gate og Gibson Assembly. Desuden bruger Golden Gate-metoden en cirkulær destinationsvektor, mens Gibson Assembly-metoden bruger en lineariseret destinationsvektor.
Den følgende infografik viser forskellen mellem Golden Gate og Gibson Assembly.
Opsummering – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekylær kloning er en metode, der bruges til at samle rekombinante DNA-molekyler og dirigere deres replikation i værtsorganismer. Golden Gate og Gibson Assembly er to molekylære kloningsmetoder, der tillader samling af flere DNA-fragmenter i et enkelt stykke. Golden Gate-metoden er afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder i en bestemt sekvens, der skal klones, mens Gibson Assembly ikke er afhængig af tilstedeværelsen af restriktionssteder i en bestemt sekvens, der skal klones. Dette er således den vigtigste forskel mellem Golden Gate og Gibson Assembly.
