Nøgleforskellen mellem nick-translation og endefyldning er, at nick-translation er en proces, der skaber mærkede DNA-prober til forskellige hybridiseringsreaktioner, mens endefyldning er en teknik, der skaber stumpede fragmenter ved at tilføje nukleotider til enkeltstrengede overhæng.
Nick-oversættelse og slutfyldning er to teknikker, der bruges i molekylærbiologi. Nick-translation anvendes til mærkning af prober til hybridisering for at påvise specifikke nukleotidsekvenser. Endefyldning bruges til at lave stumpede fragmenter, der havde klæbrige ender med enkeltstrengede udhæng. Begge teknikker har stor betydning, og de udføres rutinemæssigt i molekylære forskningslaboratorier.
Hvad er Nick Translation?
Nick-translation er en vigtig teknik, der bruges til at fremstille mærkede prober til forskellige molekylærbiologiske teknikker, såsom blotting, in situ-hybridisering, fluorescerende in situ-hybridisering osv. Det er en in vitro-metode til DNA-mærkning. DNA-prober bruges til at identificere specifikke DNA- eller RNA-sekvenser. Ved hjælp af en mærket probe kan specifikke fragmenter markeres eller visualiseres fra en kompleks blanding af nukleinsyre. Derfor fremstilles mærkede prober under anvendelse af forskellige teknikker. Nick translation er en sådan metode, som producerer mærkede prober ved hjælp af DNase 1 og DNA polymerase 1 enzymer.
Figur 01: Nick Translation
Nick-oversættelsesprocessen starter med DNase 1-enzymaktivitet. DNase 1 introducerer nicks til phosphat-rygraden af dobbeltstrenget DNA ved at sp alte phosphodiester-bindinger mellem nukleotider. Når nicket er skabt, vil den frie 3′ OH-gruppe af nukleotidet blive produceret, og DNA-polymerase 1-enzym vil virke på det. 5′ til 3′ exonukleaseaktivitet af DNA-polymerase 1 fjerner nukleotider fra nicket mod 3′-retningen af DNA-strengen.
Samtidigt virker polymeraseaktiviteten af DNA-polymerase 1-enzymet og tilføjer nukleotider for at erstatte de fjernede nukleotider. Hvis nukleotiderne er mærket, vil udskiftningen ske med de mærkede nukleotider, og det vil markere DNA'et til identifikation. Endelig kan dette nyligt syntetiserede mærkede DNA bruges som prober i forskellige hybridiseringsreaktioner.
Hvad er slutfyldning?
Endefyldning er en teknik, der bruges i molekylærbiologi til at lave stumpe fragmenter. Restriktionsfordøjelse producerer fragmenter med udhæng. Disse fragmenter er muligvis ikke kompatible til at ligere ind i plasmidvektorer. Vektorer er ofte sløvede for at gøre det muligt at sammenføje ikke-kompatible ender. Derfor kan fragmenter med udhæng gøres stumpe ved at tilføje nukleotiderne til den komplementære streng ved at bruge overhænget som skabelon for polymerisering. Denne proces er kendt som slutfyldning.
DNA-polymeraser såsom Klenow-fragment af DNA-polymerase I og T4 DNA-polymerase katalyserer endefyldningen. De tilføjer nukleotider for at udfylde (5′ → 3′) og tygge tilbage (3′ → 5′). Når først de klæbrige ender er fyldt, bliver de stumpe, og de er klar til at ligeres ind i en vektor.
Yderligere kan endefyldning bruges til at mærke DNA-molekyler. Det kan dog kun bruges til at mærke DNA-molekyler med klæbrige ender. I sammenligning med nick-oversættelse er endefyldning en skånsom metode, som sjældent forårsager DNA-brud.
Hvad er lighederne mellem Nick Translation og End Filling?
- Både nick-oversættelse og endefyldning er molekylærbiologiske teknikker.
- De kan bruges til at mærke prober.
- Begge er in vitro
Hvad er forskellen mellem Nick-oversættelse og slutfyldning?
Nick-oversættelse er en teknik, der skaber mærkede prober til hybridisering. I modsætning hertil er endefyldning en teknik, der skaber stumpe fragmenter til ligering i vektorer. Så dette er den vigtigste forskel mellem nick-oversættelse og slutfyldning. Ydermere kræver Nick-oversættelse brugen af 5'til 3' exonukleaseaktivitet, mens slutfyldning ikke kræver 5'til 3' exonukleaseaktivitet.
Nedenstående infografik tabulerer forskellene mellem nick-oversættelse og slutudfyldning mere detaljeret.
Opsummering – Nick-oversættelse vs slutfyldning
Nick-oversættelse er en metode, der inkorporerer radioaktivt mærkede nukleotider i DNA. Det syntetiserer mærkede prober baseret på aktiviteterne af DNase 1 og E. coli DNA polymerase 1 enzymer. Endefyldning er på den anden side en teknik, der producerer stumpe fragmenter. Når fragmenterne har klæbrige ender (enkeltstrengede udhæng), er det nødvendigt at gøre dem stumpe ender for at ligere til vektorer. Endefyldning tilføjer kompatible nukleotider og skaber stumpe endefragmenter for at gøre dem kompatible til ligering. Dette opsummerer således forskellen mellem nick-oversættelse og endeudfyldning.
