Nøgleforskel – Nick Translation vs Primer Extension
Nick-oversættelse og primerforlængelse er to vigtige teknikker, der udføres i molekylærbiologi. Den vigtigste forskel mellem nick-translation og primer-forlængelse er, at nick-translationsprocessen producerer mærkede prober til andre hybridiseringsteknikker, mens primer-forlængelsemetoden identificerer en specifik RNA-sekvens fra en blanding og afslører information om ekspressionen af mRNA. Begge teknikker har stor betydning og udføres rutinemæssigt i molekylære forskningslaboratorier.
Hvad er Nick Translation?
Nick-oversættelse er en vigtig teknik, der bruges til at fremstille mærkede prober til forskellige molekylærbiologiske teknikker såsom blotting, in situ hybridisering, fluorescerende in situ hybridisering osv. Det er en in vitro metode til DNA-mærkning. DNA-prober bruges til at identificere specifikke DNA- eller RNA-sekvenser. Ved hjælp af en mærket probe kan specifikke fragmenter markeres eller visualiseres fra en kompleks blanding af nukleinsyre. Derfor fremstilles mærkede prober under anvendelse af forskellige teknikker, der skal anvendes til forskellige teknikker. Nick translation er en sådan metode, som producerer mærkede prober ved hjælp af DNase 1 og DNA polymerase 1 enzymer.
Nick-oversættelsesprocessen starter med DNase 1-enzymaktivitet. DNase 1 introducerer hak i phosphat-rygraden af dobbeltstrenget DNA ved at sp alte phosphodiester-bindinger mellem nukleotider. Når nicket er skabt, vil fri 3' OH-gruppe af nukleotidet blive givet, og DNA-polymerase 1-enzym vil virke på det. 5' til 3' exonukleaseaktivitet af DNA-polymerase 1 fjerner nukleotider fra nicket mod 3'-retningen af DNA-strengen. Samtidig virker polymeraseaktiviteten af DNA-polymerase 1-enzymet og tilføjer nukleotider for at erstatte de fjernede nukleotider. Hvis nukleotiderne var mærket, vil udskiftningen ske med de mærkede nukleotider, og det vil markere DNA'et til identifikation. Dette nyligt syntetiserede mærkede DNA kan bruges som prober i forskellige hybridiseringsreaktioner i molekylærbiologi.
Figur 01: Nick-oversættelsesproces
Hvad er Primer Extension?
Primer-forlængelse er en teknik, som bruges til at finde specifik RNA-sekvens fra en RNA-blanding og lokalisere 5'-enden af mRNA-transkriptet. Det bruges også til at studere strukturen af RNA og ekspression. Primerforlængelsemetoden udføres med mærkede primere eller med mærkede nukleotider. Hvis der anvendes mærkede primere, udelukker det behovet for at mærke de nukleotider, der anvendes til syntesen af cDNA. Der er flere trin i denne teknik. Det starter med ekstraktion af RNA fra prøven. Derefter tilsættes en mærket oligonukleotidprimer til blandingen sammen med de nødvendige ingredienser til at syntetisere cDNA af en specifik RNA-sekvens. Primer annealer med den komplementære sekvens fra blandingen. Ved at bruge den primer-annealede sekvens som skabelonen syntetiserer enzymet revers transkriptase det komplementære DNA (cDNA) af RNA-sekvensen. Primer-annealing og revers transkription forekommer kun, når den specifikke RNA-sekvens er til stede i prøven. Endelig, når denaturerende gelelektroforese udføres, kan størrelsen af RNA-sekvensen bestemmes. Det er også let at finde +1-basen af mRNA-sekvensen (transkriptionsinitieringssted) ved hjælp af primerforlængelsemetoden. Mængden af mRNA til stede i prøven kan kvantificeres ved denne metode, hvis der anvendes overskydende primer.
Figur 02: Primer-udvidelse
Hvad er forskellen mellem Nick Translation og Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick-oversættelse er en proces, der skaber mærkede DNA-prober til forskellige hybridiseringsreaktioner. | Primer extension er en teknik, der bruges til at finde specifikt RNA eller til at studere genekspression. |
| Enzymer brugt | |
| DNase 1 og DNA-polymeraseenzymer bruges. | Omvendt transkriptase-enzym bruges. |
| Vigtigt | |
| Nick-oversættelse letter markeringen af specifik DNA-sekvens. | Primer-forlængelse muliggør detektion af specifik mRNA-sekvensstørrelse og mængden til stede i prøven. |
Opsummering – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translation er en metode, der bruges til at syntetisere mærkede prober baseret på aktiviteterne af DNase 1 og E coli DNA polymerase 1 enzymer. Det er en in vitro-metode, der anvendes i laboratorierne forud for forskellige hybridiseringsteknikker. Under nick-translationen fjerner 5'-3' exonukleaseaktivitet af DNA-polymerase 1 nukleotider foran nicket, og polymeraseaktiviteten af DNA-polymerase 1 erstatter de fjernede nukleotider med mærkede nukleotider bag nicket. Primerforlængelse er en metode, der bruges til at detektere et specifikt RNA-transkript fra en blanding og kvantificere størrelsen og mængden af interesse-RNA'et. Dette er forskellen mellem nick-oversættelse og primer-forlængelse.
