Forskellen mellem Northern Southern og Western Blotting

2024 Forfatter: Alex Aldridge | [email protected]. Sidst ændret: 2023-12-17 13:35

Nøgleforskel – Northern vs Southern vs Western Blotting

Detektion af specifikke sekvenser af DNA, RNA og proteiner er afgørende for forskellige typer undersøgelser i molekylærbiologi. Gelelektroforese er en teknik, der adskiller DNA, RNA og proteiner efter deres størrelse. Fra gelprofilerne detekteres en bestemt DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein ved de specielle teknikker, der kaldes blotting og hybridisering med mærkede prober. Der er tre forskellige typer blotting-metoder, nemlig sydlig, nordlig og vestlig. Den vigtigste forskel mellem nordlige sydlige og vestlige blotting ligger i typen af det molekyle, det detekterer fra en prøve. Southern blotting er en metode, der detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Northern blotting er en teknik, der detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve. Western blotting er en metode, der detekterer et specifikt protein fra en proteinprøve.

Hvad er Southern Blotting?

Southern blotting-teknik blev udviklet af E. M. Southern i 1975 til identifikation af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Dette er den første blotting-teknik, der blev introduceret i molekylærbiologi. Det muliggjorde påvisning af specifikke gener fra DNA'et, specifikke fragmenter fra DNA'et osv. Der er flere trin involveret i southern blotting-teknik. De er som følger.

1. DNA isoleres fra prøven og fordøjes med restriktionsendonukleaser.
2. Fordøjet prøve adskilles ved agarosegelelektroforese.
3. DNA-fragmenter i gelen denatureres til enkeltstrenge ved brug af en alkalisk opløsning.
4. Enkeltstrenget DNA overføres til en nitrocellulosefiltermembran ved kapillæroverførsel.
5. Overført DNA fikseres permanent på membranen.
6. Fasteret DNA på membranen hybridiseres med mærkede prober.
7. Ubundet DNA vaskes af fra membranen ved vask.
8. Røntgenfilm udsættes for membranen, og der fremstilles en autoradiograf.

Southern blotting anvendes til forskellige aspekter af molekylærbiologi. Det er nyttigt i RFLP-kortlægning, retsmedicinske undersøgelser, DNA-methylering i genekspression, påvisning af muterede gener i genetiske lidelser, DNA-fingeraftryk osv.

Figur 01: Southern Blotting Technique

Hvad er Northern Blotting?

Northern blotting er en metode designet til at detektere en specifik RNA-sekvens eller mRNA-sekvens fra en prøve for at studere genekspression. Denne teknik blev udviklet af Alwine, Kemp og Stark i 1979. Den adskiller sig fra de sydlige og vestlige blotting-teknikker på grund af flere trin. Denne teknik udføres dog også via gelelektroforese, blotting og hybridisering med specifikke mærkede prober og detektion. Northern blotting-teknik udføres som følger.

1. RNA ekstraheres fra prøven og separeres ved gelelektroforese.
2. RNA overføres fra gelen til en blotting-membran og fikseres.
3. Membranen behandles med en mærket probe fremstillet ud fra cDNA eller RNA (proben er komplementær til en specifik sekvens i prøven).
4. Proben inkuberes med membranen for at binde med en specifik sekvens.
5. Ubundne prober vaskes af.
6. Hybridiserede fragmenter detekteres af en autoradiograf.

Northern blotting er et vigtigt værktøj til påvisning og kvantificering af hybridiseret mRNA, undersøgelse af RNA-nedbrydning, evaluering af RNA-halveringstid, påvisning af RNA-splejsning, undersøgelse af genekspression osv.

Figur 02: Northern Blotting

Hvad er Western Blotting?

Western blotting er en metode til at påvise et specifikt protein fra en proteinblanding ved brug af mærket antistof. Derfor er western blot også kendt som en immunoblot. Denne teknik blev introduceret af Towbin et al i 1979, og den udføres nu rutinemæssigt i laboratorierne til proteinanalyse. Trinene er som følger.

1. Proteiner udvindes fra prøven
2. Proteiner adskilles efter deres størrelse ved hjælp af polyakrylamidgelelektroforese
3. Separerede molekyler overføres til en PVDF-membran eller nitrocellulosemembran ved elektroporation
4. Membranen er blokeret for uspecifik binding med antistofferne
5. Overførte proteiner er bundet med primært antistof (enzymmærkede antistoffer).
6. Membranen vaskes for at fjerne ikke-specifikt bundne primære antistoffer
7. Bundne antistoffer detekteres ved at tilføje et substrat og detektere det dannede farvede bundfald

Western blotting er nyttig til påvisning af anti-HIV-antistoffer i en human serumprøve. Western blot kan også bruges som bekræftende test for hepatitis B-infektion og endelig test for kogalskab.

Figur 03: Western Blotting

Hvad er forskellen mellem Northern Southern og Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Molekyletype fundet
Northern Blotting	Northern blotting detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve.
Southern Blotting	Southern blotting detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve.
Western Blotting	Western blotting detekterer et specifikt protein fra en proteinprøve.
Type of Gel
Northern Blotting	Denne bruger agarose/formaldehyd gel.
Southern Blotting	Dette bruger en Agarose-gel.
Western Blotting	Dette bruger polyakrylamidgel.
Blottemetode
Northern Blotting	Dette er en kapillaroverførsel.
Southern Blotting	Dette er en kapillaroverførsel.
Western Blotting	Dette er en elektrisk overførsel.
Sonder brugt
Northern Blotting	cDNA- eller RNA-prober mærket radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Southern Blotting	DNA-sonder er mærket radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Western Blotting	Primære antistoffer bruges som prober.
Detektionssystem
Northern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiograf eller detektering af lys eller farveændring.
Southern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiograf, detektering af lys eller farveændring.
Western Blotting	Dette gøres ved at detektere lys eller farveændringer.

Oversigt – Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting er en speciel teknik udviklet til identifikation af specifikt DNA, RNA eller protein fra prøverne. Der er tre separate blotting-procedurer, nemlig northern, southern og western, til at detektere en specifik type molekyle. Northern blotting-teknik er designet til at detektere en specifik RNA-sekvens fra en blanding af RNA. Southern blotting-teknik muliggør påvisning af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve, og western blotting-teknik er udviklet til at identificere et specifikt protein fra en proteinblanding.