Nøgleforskel – SDS-side vs Western Blot
Western blotting er en teknik, der detekterer et specifikt protein fra en proteinprøve. Denne teknik udføres via flere nøgletrin: gelelektroforese, blotting og hybridisering. Natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-side) er en slags gelelektroforeseteknik, som bruges til at adskille proteiner efter deres størrelse (molekylvægt). Western blot er et specielt ark af en blotting-membran, som bruges til at overføre det samme mønster af proteinerne på SDS-siden. Den vigtigste forskel mellem SDS Page og western blot er, at SDS Page tillader adskillelse af proteiner i en blanding, mens western blot tillader påvisning og kvantificering af et specifikt protein fra en blanding. Begge er nyttige i proteinanalyseundersøgelser.
Hvad er SDS-side?
SDS Page er en gelelektroforeseteknik, der bruges til proteinseparation. Det er almindeligt anvendt i biokemi, genetik, retsmedicin og molekylærbiologi. Når først proteinerne er ekstraheret fra prøven, køres de på en gel, der består af SDS og polyacrylamid. SDS er et anionisk detergent, som bruges til at linearisere proteiner (denaturere proteiner) og til at give en negativ ladning til lineariserede proteiner proportion alt med deres molekylære masse. Polyacrylamid bliver den faste støtte for gelen. Denaturerede proteiner, som er negativt ladede, migrerer mod den positive ende af apparatet gennem gelen. I henhold til proteinernes størrelse er migreringshastighederne forskellige mellem proteiner, og der sker adskillelse. Derfor er SDS-siden nyttig til adskillelse af individuelle proteiner baseret på deres størrelser.
Fremstillingen af polyacrylamidgelen til fraktionering af proteiner er et afgørende trin i SDS-siden. Den korrekte koncentration af polyacrylamid og typen af det anvendte tværbindingsmiddel påvirker i høj grad gelens fysiske egenskaber, hvilket gør selve adskillelsen af de forskellige proteiner. Gelens porestørrelser bør administreres korrekt for effektiv adskillelse. SDS-side anses dog for at være en proteinseparationsteknik med høj opløsning.
SDS-sideteknikken har en stor begrænsning i proteinanalyse. Da SDS denaturerer proteiner før adskillelse, tillader det ikke påvisning af enzymatisk aktivitet, proteinbindingsinteraktioner, proteincofaktorer osv.
Figur 01: SDS-side
Hvad er Western Blot?
Western blotting-teknik muliggør påvisning af et specifikt protein fra en proteinblanding og måling af proteinets mængde og molekylvægt. Western blot er den membran, der bruges under blotting-proceduren for at få et spejlbillede af proteinmønstrene i SDS-polyacrylamidgelen. Membranen, som bruges til western blotting, består for det meste af nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF). Membranen med det overførte protein kan bruges til at identificere det ønskede protein. Det kræver antistof af høj kvalitet til påvisning af det ønskede protein ved hybridisering. Antistoffet binder til dets specifikke antigen og afslører tilstedeværelsen af det ønskede antigen, som er et protein.
Overførsel af proteinerne fra SDS-polyacrylamidgelen til western-blotten udføres ved elektroblotting. Det er en effektiv og hurtig metode, som får proteinerne til at elektroforese ud af gelen og passere over på nitrocellulosemembranen (western blot).
Figur 02: Western Blot
Hvad er forskellen mellem SDS-side og Western Blot?
SDS-side vs Western Blot |
|
| SDS-siden er en gelelektroforeseteknik. | Western blot er en teknik, der udføres på en membran for at detektere et specifikt protein fra en blanding. |
| Brug | |
| SDS-siden tillader adskillelse af proteiner i henhold til deres størrelser. | Western blot tillader overførsel af proteiner på SDS-sidegelen uden at ændre dets mønster og muliggør hybridisering med specifikke antistoffer. |
| Ulemper | |
| Proteindenaturering, høje omkostninger og tilstedeværelsen af neurotoksinkemikalier er ulemperne ved denne teknik. | Denne teknik er tidskrævende og kræver en god erfaren personlig og specifikke kontrollerede forhold. |
Opsummering – SDS-side vs Western Blot
SDS-side og western blot er to metoder involveret i proteinanalyse. SDS Page tillader nem adskillelse af proteiner på en gel i henhold til deres molekylvægt. Western blot hjælper med at bekræfte tilstedeværelsen og mængden af et specifikt protein gennem hybridisering med specifikke antistoffer. Dette er forskellen mellem SDS-side og western blot.
