Nøgleforskel – RAPD vs RFLP
Genetiske markører bruges i molekylærbiologi til at identificere genetiske variationer mellem individer og arter. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) og Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) er to vigtige molekylære markører, der rutinemæssigt anvendes i laboratorier. RAPD udføres med korte og vilkårlige oligonukleotidprimere, og den er baseret på den tilfældige amplifikation af de flere steder i organismens skabelon-DNA. RFLP udføres med en specifik restriktionsendonuklease, og den er baseret på polymorfien af resulterende restriktionsfragmenter og hybridisering. Den vigtigste forskel mellem RAPL og RFLP er, at RAPD er en type PCR-teknik, der udføres uden forudgående sekvensviden, hvorimod RFLP ikke er involveret i PCR og kræver forudgående sekvensviden for at udføre teknikken.
Hvad er RAPD?
RAPD er en nyttig molekylær markør i molekylærbiologi. Det er en hurtig og nem teknik. RAPD kan defineres som en metode, der resulterer i polymorfe DNA-sekvenser som et resultat af tilfældig amplifikation af flere placeringer af mål-DNA-skabelonen. RAPD bruger korte oligonukleotidprimere med arbitrære sekvenser til PCR-amplifikationen. Primere syntetiseres kunstigt uden forudgående sekvensviden. Derfor betragtes det som en nem og nyttig teknik.
De følgende vigtige trin er involveret i RAPD.
- Udtrækning af mål-DNA
- Amplifikation af de multiple placeringer af mål-DNA'et ved hjælp af tilfældigt udvalgte primere
- Gelelektroforese af de amplificerede PCR-produkter
- Farvning med ethidiumbromid og identifikation af polymorfien
Som et resultat af variationen i primer-annealingen genereres forskellige fragmenter med forskellige længder under amplifikationen. Derfor er båndmønstre på gelerne forskellige blandt individer og arter. Således muliggør RAPD påvisning af genetisk variation blandt organismer i identifikation og differentiering.
RAPD anvendes i forskellige undersøgelser af molekylærbiologi, såsom identifikation af den genetiske forskel mellem nært beslægtede arter, genkortlægning, DNA-fingeraftryk, identifikation af arvelige sygdomme osv.
Figur 01: RAPD
Hvad er RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP'er) er en molekylær markør, der bruges i molekylærbiologi til identifikation af genetisk variation i homologe DNA-sekvenser. Det er den første genetiske markør udviklet til DNA-fingeraftryk. Alle organismer producerer unikke DNA-profiler, når de begrænses med specifikke restriktionsenzymer. RFLP tjener som et vigtigt værktøj til at producere unikke DNA-profiler af individer og påvisning af genetisk variation blandt dem. Når DNA-prøver fordøjes med specifikke restriktionsendonukleaser, giver det forskellige DNA-profiler, som er unikke for hvert individ. Derfor er princippet i denne metode påvisningen af genetisk variation blandt organismer ved at begrænse homologt DNA med specifikke restriktionsenzymer og analyse af fragmentlængdepolymorfien via gelelektroforese og blotting. Blottingmønstre er unikke for hver organisme og karakteriserer de specifikke genotyper.
Følgende trin er involveret i RFLP.
- Isolering af tilstrækkelig mængde DNA fra prøver
- Fragmentering af DNA-prøverne med specifikke restriktionsendonukleaser i kort sekvens
- Separation af de resulterende fragmenter med forskellige længder ved agarosegelelektroforese.
- Overførsel af gelprofilen til en membran ved Southern blotting
- Hybridisering af membranen med mærkede prober og analyse af fragmentlængdepolymorfi i hver profil
RFLP har forskellige applikationer såsom diagnosticering af arvelige sygdomme, genomkortlægning, kriminel identifikation i retsmedicinske undersøgelser, faderskabstest osv.
Figur 02: RFLP-genotypning
Hvad er forskellen mellem RAPD og RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD er en molekylær markør baseret på tilfældige primere og PCR. | RFLP er en molekylær markør baseret på produktionen af restriktionsfragmenter med forskellig længde. |
| påkrævet prøve | |
| Små DNA-prøver er nok til RAPD-analysen. | En stor mængde ekstraheret DNA-prøve er påkrævet til RFLP-analyse. |
| Tid | |
| RAPD er en hurtig proces. | RFLP er en tidskrævende proces. |
| Primer Use | |
| Der bruges tilfældige primere, og de samme primere kan bruges til forskellige arter. | Artsspecifikke prober bruges i RFLP til hybridisering. |
| Plidelighed | |
| Teknikkens pålidelighed er mindre sammenlignet med RFLP. | RFLP er en pålidelig teknik. |
| Blotting | |
| RAPD involverer southern blotting. | Southern blotting er et trin i RFLP. |
| Detektion af allelvariation | |
| Alleliske variationer kan ikke detekteres af RAPD. | Alleliske variationer kan detekteres af RFLP. |
| Need for Sequence Knowledge | |
| RAPD kræver ikke forudgående sekvensviden. | Forudgående sekvensviden er påkrævet for probedesign. |
| PCR | |
| PCR er involveret i RAPD | PCR er ikke involveret i RFLP. |
| Reproducerbarhed | |
| RAPD har en lav reproducerbarhed | RFLP har en høj reproducerbarhed sammenlignet med RAPD. |
Opsummering – RAPD vs RFLP
RAPD og RFLP er vigtige markører, der bruges i molekylærbiologi. Begge metoder er i stand til at detektere genetisk variation blandt organismer. RAPD udføres ved hjælp af tilfældige primere. RFLP udføres under anvendelse af specifikke restriktionsenzymer. Begge metoder producerer DNA-profiler, der er unikke for individuelle organismer. RAPD er involveret relativt få trin end RFLP. Men det giver mindre pålidelige og reproducerbare resultater end RFLP. Dette er hovedforskellen mellem RAPD og RFLP.
