Nøgleforskel – AFLP vs RFLP
DNA-undersøgelser har en enorm betydning for forståelse og bestemmelse af fylogenetiske forhold, diagnosticering af genetiske sygdomme og kortlægning af organismers genomer. Adskillige teknikker forbundet med DNA-analyse bruges også til identifikation af et bestemt gen eller en DNA-sekvens i en pulje af ukendt DNA. De er kendt som molekylære markører. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) og Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) er to sådanne molekylære markører (metoder), der er udviklet i molekylærbiologi til at detektere genetisk variation mellem organismer. Begge metoder er lige vigtige og har fordele og ulemper. Den vigtigste forskel mellem AFLP og RFLP er, at AFLP involverer selektiv PCR-amplifikation af det fordøjede DNA, mens RFLP ikke involverer selektiv PCR-amplifikation af DNA-fragmenterne.
Hvad er AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) er et vigtigt værktøj i molekylærbiologi og bruges i vid udstrækning i genetisk variationsanalyse. AFLP er baseret på den specifikke PCR-amplifikation af det fragmenterede genomiske DNA og påvisning af polymorfien ved autoradiografier via gelelektroforese. AFLP bidrager i vid udstrækning til at identificere genetiske forskelle i stammer eller nært beslægtede arter af forskellige kongeriger, herunder planter, dyr, bakterier og svampe. AFLP kan udføres med små mængder af ukendte DNA-prøver. Det kræver ikke forudgående sekvenskendskab og design af sonder.
Trin af AFLP
- Isolering af DNA
- Fordøjelse af DNA'et med restriktionsendonukleaser
- Ligering af de begrænsede DNA-fragmenter med adaptere
- Selektiv amplifikation af fragmenterne med specifikke restriktionssteder
- Separation af PCR-produkterne ved gelelektroforese
- Visualisering af gelmatrixen ved autoradiograf
AFLP er en mere følsom og reproducerbar metode, som kan bruges til DNA-profilering af flere taxa, herunder svampe, bakterier, planter og dyr uden forudgående kendskab til DNA-sekvenser. Det hjælper med at identificere små forskelle mellem individer i populationer på grund af dets meget følsomme natur. AFLP er også vigtig i genomkortlægning, retsmedicinske undersøgelser, forældretests, genotypebestemmelse osv.
Figur 01: AFLP
Hvad er RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP'er) er en teknik, der bruges til at detektere de genetiske variationer i homologe DNA-sekvenser. Det er den første metode, der er udviklet til DNA-profilering. Organismer har unikke DNA-fingeraftryk eller DNA-profiler. RFLP tjener som et vigtigt værktøj til at analysere variationen mellem DNA-profiler af intraspecifikke eller nært beslægtede organismer, da homologe sekvenser har forskellige restriktionssteder (placeringer), der er unikke for en bestemt organisme. Når homologt DNA fordøjes med specifikke restriktionsendonukleaser, vil det resultere i forskellige DNA-profiler, som er unikke for hvert individ. Derfor er princippet i denne metode påvisningen af genetisk variation blandt organismer ved at begrænse homologt DNA med specifikke restriktionsenzymer og analyse af fragmentlængdepolymorfien via gelelektroforese og blotting. Blottingmønstre er unikke for hver organisme og karakteriserer de specifikke genotyper.
Trin af RFLP
- Isolering af tilstrækkelig mængde DNA fra prøver
- Fragmentering af DNA-prøverne med specifikke restriktionsendonukleaser i kort sekvens
- Separation af de resulterende fragmenter med forskellige længder ved agarosegelelektroforese.
- Overførsel af gelprofilen til en membran ved Southern blotting
- Hybridisering af membranen med mærkede prober og analyse af fragmentlængdepolymorfi i hver profil
RFLP er en meget vigtig teknik til at opdage sygdomsarv og finde risikoen for, at sygdommen opstår blandt familiemedlemmer. RFLP bruges også hyppigt til genomkortlægning, identifikation af kriminelle i retsmedicin, faderskabstest osv. RFLP har også flere begrænsninger. RFLP kræver forudgående viden om sekvensdata for at designe prober til hybridisering. Det kræver også isolering af tilstrækkelig mængde DNA fra prøven til at analysere, hvilket er svært i retsmedicinske undersøgelser.
Figur 01: RRFLP-kortlægning
Hvad er forskellen mellem AFLP og RFLP?
ALFP vs RFLP |
|
| AFLP involverer selektiv PCR-amplifikation af det fordøjede DNA. | RFLP involverer ikke PCR, medmindre det er PCR-RFLP. |
| Sequence Knowledge | |
| Forudgående sekvenskendskab er ikke påkrævet. | Forudgående sekvenskendskab er påkrævet for at designe RFLP-sonder. |
| Plidelighed | |
| Dette er mere pålideligt. | Dette er mindre pålideligt sammenlignet med AFLP. |
| Effektivitet i detektering af polymorfi | |
| Dette har en højere effektivitet til at detektere polymorfi end RFLP. | Dette er mindre effektivt sammenlignet med AFLP. |
| Pris | |
| Dette er lidt dyrt sammenlignet med RFLP. | Dette er billigere sammenlignet med AFLP. |
| Applications | |
| AFLP'er er blevet anvendt til genomkortlægning, DNA-fingeraftryk, genetisk diversitetsundersøgelser, faderskabstest og retsmedicin | RFLP-analyse er et vigtigt værktøj i genomkortlægning, lokalisering af gener for genetiske lidelser, bestemmelse af risiko for sygdom og faderskabstest. |
Oversigt – AFLP vs RFLP
AFLP og RFLP er to teknikker, der bruges som genetiske markører til evaluering af diversitet og vurdering af de genetiske forhold i molekylærbiologi. AFLP fungerer som en effektiv og følsom metode til påvisning af genetisk polymorfi mellem organismer end RFLP. Men selvom begge disse metoder har forskellig effektivitet til at påvise genetiske variationer, bruges de stadig til DNA-fingeraftryk og sygdomsdiagnose.
