Nøgleforskel – SDS-side vs Native Page
SDS og native page er to typer polyakrylamidgelelektroforeseteknikker, der bruges i molekylærbiologi. Den vigtigste forskel mellem SDS Page og Native Page er den anvendte type polyacrylamidgel. I SDS Page anvendes en denaturerende gel, derfor separeres molekyler baseret på deres molekylvægt. I modsætning hertil anvendes ikke-denaturerende geler i Native Page. Derfor adskilles molekyler baseret på deres størrelse, ladning og form.
Polyacrylamid Gel Electrophoresis (Page) bruger en gel fremstillet ved at polymerisere akrylamidmonomerer med methylenbisacrylamid. Polyacrylamidet er mere sejt og mere varmestabilt end agarose. Polyacrylamidgelerne har en mindre porestørrelse, der muliggør effektiv adskillelse af proteiner. Der er to hovedtyper af sideopsætninger, nemlig SDS-side og indbygget side. SDS Page eller Sodium-Dodecyl Sulfate Polyacrylamid gelelektroforese adskiller proteiner baseret på deres molekylvægte. Denaturerende geler bruges i SDS Page. Native Page bruger ikke-denaturerende geler og adskiller proteiner baseret på deres størrelse, ladning og form (3D-konformation).
Hvad er SDS-side?
SDS-side er den mest almindelige elektroforetiske teknik, der bruges til at adskille proteiner baseret på deres molekylvægt. Gelen laves ved at tilsætte SDS (Sodium dodecyl sulfate), som er et vaskemiddel. SDS proteser omdannes til monomerer af proteiner. SDS er et anionisk rengøringsmiddel. Derfor tilføjer det en netto negativ ladning til proteinerne inden for et bredt pH-område. Når den negative nettoladning påføres proteinmolekylerne, nedbrydes de komplekse strukturer på grund af ladningsvariationen. På grund af den negative ladning tiltrækker proteiner mod den positive ende. Således rejser molekyler med lavere molekylvægt hurtigere på gelmatrixen og kan observeres tæt på anoden, hvorimod proteiner med højere molekylvægt observeres tættere på brøndene.
Figur 01: SDS-side
SDS-bindingen til polypeptidkæden er proportional med dens relative molekylmasse. Derfor kan molekylmassen også bestemmes via SDS Page. Farvningen af SDS Page-gelerne udføres ved farvning med bromphenolblåt. Anvendelser af SDS-side spænder i større udstrækning, hvor det kan bruges til at estimere den relative molekylære masse og til at bestemme den relative mængde af proteiner i en proteinblanding. SDS-siden kan også bruges til at bestemme proteinfordelingen i en blanding af proteiner. SDS Page anvendes også til at rense og vurdere proteiner. Det bruges som en indledende procedure til western blotting og hybridisering, som igen bruges til proteinkortlægning og identifikation.
Hvad er Native Page?
Native polyacrylamid gelelektroforese (Native Page) bruger en ikke-denaturerende gel. Derfor tilsættes SDS eller noget andet denatureringsmiddel ikke til gelmatrixen. I Native Page er adskillelsen af proteiner baseret på ladningen og størrelsen af proteinet. Derfor afhænger proteinets mobilitet af ladningen og størrelsen af proteinet.
Proteinets ladning afhænger af aminosyrernes sidekæder. Hvis sidekæderne er negativt ladede, vil proteinet få en samlet negativ ladning og omvendt. Proteiner bevarer en 3D-konformation på grund af den foldning, der finder sted. Folding er resultatet af de forskellige bindingstyper i proteiner, såsom disulfidbindinger, hydrofobe interaktioner og hydrogenbindinger. Derfor, hvis den native Page bæres ved en neutral pH, vil proteinerne blive adskilt i henhold til proteinets molekylære form. Derfor kan Native Page bruges som en følsom teknik til at detektere ændringen i ladning eller konformation af proteinet.
Den største fordel ved native Page er, at proteinet, der bruges til Page-analysen, kan genvindes i sin oprindelige tilstand efter Page-analysen, da proteinet ikke forstyrres under processen. Native Page er en relativt høj gennemløbsteknik, og proteinets stabilitet øges.
Figur 02: Indbygget side
Efter afslutning af gel-kørslen kan Native Page-gelen ses ved at farve med bromphenolblåt eller et andet passende farvningsreagens. Anvendelserne af Native Page omfatter adskillelse af sure proteiner, herunder glycoproteiner, såsom humant rekombinant erythropoietin eller identifikation af proteiner til stede i bovint serumalbumin (BSA).
Hvad er lighederne mellem SDS-side og oprindelig side?
- Både SDS Page- og Native Page-systemer bruger polyacrylamidgel som gelens matrix.
- Begge bruges til adskillelse og identifikation af proteiner.
- Begge bruger elektroforetisk mobilitet til at adskille forbindelserne.
- Begge kan udføres på en lodret måde eller vandret måde (for det meste udført som lodrette sideopsætninger, fordi kørselslængden er længere).
- Elektroforeseapparatet inklusive geltanken, kamme, strømforsyningen er påkrævet til driften af begge teknikker.
- Visualiseringen af gelen kan udføres ved hjælp af farvningsmetoder i begge teknikker.
Hvad er forskellen mellem SDS-side og native-side?
SDS-side vs. oprindelig side |
|
| SDS Page eller Sodium-dodecyl sulfate Page adskiller proteiner baseret på deres molekylvægt, og den bruger en denaturerende gel. | Native Page bruger ikke-denaturerende geler og adskiller proteiner baseret på deres størrelse, ladning og form (3D-konformation). |
| Geltype | |
| Der bruges en denaturerende gel på SDS-siden. | En ikke-denaturerende gel bruges på den oprindelige side. |
| Tilstedeværelse af SDS | |
| SDS er til stede som et rengøringsmiddel for at give en negativ ladning på prøven på SDS-siden. | SDS er ikke til stede på den oprindelige side. |
| Adskillelsesgrundlag | |
| Separation af proteiner afhænger af proteinets molekylvægt på SDS-siden. | Separation afhænger af størrelsen og formen af proteinmolekylet på den oprindelige side. |
| Proteinets stabilitet | |
| Proteinets stabilitet er lav på SDS-siden. | Proteinets stabilitet er høj på den oprindelige side. |
| Genvinding af det originale protein | |
| Ikke muligt, da det er denatureret på SDS-siden. | Muligt på den oprindelige side. |
Opsummering – SDS-side vs. oprindelig side
SDS Page og Native Page er to typer polyacrylamidgelelektroforeseteknikker, der bruges til at adskille proteiner. SDS Page er behandlet med et vaskemiddel kaldet SDS. SDS giver proteinet en generel negativ ladning, som derefter resulterer i denaturering af proteinet. Derfor separeres proteinerne baseret på deres molekylvægt. I modsætning hertil bruger Native Page-teknikken ikke noget denatureringsmiddel. Således er proteinerne enten adskilt baseret på deres størrelse eller form. Dette er forskellen mellem SDS-side og native-side.
