Nøgleforskel – varm vs kold trypsinisering
Varm og kold trypsinisering er to metoder, der bruges til enzymatisk disaggregering af celler i dyrecelledyrkning. Nøgleforskellen mellem varm og kold trypsinisering, som navnene antyder, afhænger af den temperatur, hvor trypsinet tilsættes til cellulær disaggregering. Varm trypsinisering finder sted under højere temperaturforhold (36,5 – 37 0C), hvorimod kold trypsinisering finder sted under lave temperaturforhold.
Under processen med primær celledyrkning af dyreceller er der tre hovedmetoder, der anvendes og har vist sig at være succesfulde. De tre metoder omfatter mekanisk adskillelse af celler, enzymatisk adskillelse af celler og den primære eksplantationsteknik. Den enzymatiske adskillelse af celler, der fører til isolering af celler, og det sker af det proteinnedbrydende enzym trypsin. Derfor er denne proces kendt som trypsinisering. Trypsinisering kan udføres under to forskellige forhold, nemlig varm trypsinisering og kold trypsinisering. Varm trypsinisering er metoden til at behandle cellerne med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 – 37 0C. Kold trypsinisering er processen med trypsinbehandling, der finder sted under koldere forhold, fortrinsvis i is, der opretholder meget lave temperaturer.
Hvad er varm trypsinisering?
Trypsinisering kan udføres for at adskille de cellulære komponenter for at isolere cellerne for at producere en primær cellekultur. Trypsin er et proteinnedbrydningsenzym, og enzymblandingen, der anvendes til trypsinisering, kan enten være et råekstrakt eller et oprenset produkt. Råekstraktet siges at være mere effektivt til proteinlyse og cellesintegration, da det indeholder andre nedbrydende enzymer.
Varm trypsinisering er den mest almindeligt anvendte enzymatiske metode til celleopdeling, der finder sted under højere temperaturforhold. Forud for behandlingen ved trypsinisering hakkes det ønskede væv i mindre stykker. Det letter den nemme opdelingsproces. Det hakkede væv vaskes derefter i et specielt medium kendt som Dissection Basal S alt medium.
Efter afslutningen af vasketrinnet omdannes cellerne til en kolbe indeholdende det aktive enzym, som er trypsin. Da denne teknik indebærer en varm trypsiniseringsprotokol, placeres trypsinet ved en temperatur på omkring 37 0C i omkring fire timer.
Figur 01: Trypsin
Indholdet blandes og omrøres ved at bruge centrifugeringsmetoder for at lette protokollen og for at fremskynde disaggregeringsprocessen. Når den anbefalede tid er opnået, kan cellerne udledes fra supernatanten. Cellerne afledt af supernatanten inkuberes derefter ved en bestemt temperatur og tid.
Hvad er kold trypsinisering?
Kold trypsinisering er den anden type trypsinisering, der finder sted under kolde forhold. I denne teknik bliver cellerne, der hakkes og vaskes, anbragt i hætteglas på is og derefter gennemblødt med trypsin. Iblødsætningsperioden er meget længere – omkring 6 – 24 timer.
Efter afslutning af iblødsætningsproceduren fjernes trypsinet fra cellelysatet, og vævsstykkerne inkuberes yderligere ved 37 0C i ca. 20 – 30 minutter. Nedbrydningen af cellerne fremkaldes ved gentagen pipettering af vævsblandingen. Dette vil tillade cellerne at dissociere fra membranen og komme til supernatanten. Når først cellerne er i supernatanten, inkuberes de og dyrkes ved en ønsket temperatur og tidsperiode.
Den kolde trypsiniseringsmetode har flere fordele
- Højere udbytte af levedygtige celler, da celleskaden minimeres. Celleskaden minimeres ved ikke at bruge centrifugeringstrin.
- Meget praktisk metode.
- Mindre besværlig.
Den vigtigste begrænsning ved kold trypsiniseringsmetoden er, at store mængder ikke kan bruges i én instans.
Hvad er lighederne mellem varm og kold trypsinisering?
- Både varm og kold trypsiniseringsprocesser bruger enzymet trypsin til disaggregering af celler.
- Både varm og kold trypsiniseringsprocesser bruges i cellekulturprocedurer til adskillelse af celler.
- I både varm og kold trypsiniseringsbehandlingsprocedurer stammer cellerne fra supernatanten.
Hvad er forskellen mellem varm og kold trypsinisering?
Varm vs. Kold Trypsinisering |
|
| Varm trypsinisering er metoden til at behandle cellerne med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 – 37 0. | Kold trypsinisering er processen med trypsinbehandling, der finder sted under koldere forhold, fortrinsvis i is, der opretholder meget lave temperaturer. |
| Protokol | |
| De hakkede vævsstykker holdes ved 37 0C kontinuerligt under hele proceduren. | De hakkede vævsstykker holdes i starten ved iskold temperatur og derefter ved 37 0. |
| Temperature | |
| Varm trypsinisering forekommer ved 36,5 – 37 0 | Kold trypsinisering forekommer ved iskolde temperaturer. |
| Tidsforbrug | |
| Der kræves mindre tid til hele processen (ca. 4 timer) med varm trypsinisering. | Længere tid påkrævet (ca. 6 – 24 timer) til kold trypsinisering. |
| Udbytte af levedygtige celler | |
| Lavt varm trypsinisering. | Høj i kold trypsinisering. |
| Brug af centrifugering | |
| Centrifugering er påkrævet til disaggregering af celler i varm trypsinisering. | Centrifugering er ikke påkrævet ved kold trypsinisering. |
| Initial vævsmængde til trypsinisering | |
| En større mængde væv kan bruges til varm trypsinisering. | En mindre mængde væv kan bruges til kold trypsinisering. |
| Celleskade | |
| Høj på grund af centrifugering i varm trypsinisering. | Mindre på grund af kold trypsinisering. |
Opsummering – varm vs kold trypsinisering
Trypsinisering er metoden til at bruge det proteinnedbrydende enzym trypsin til disaggregering og fremstilling af primære cellekulturer under celledyrkningsprocessen. Der er to hovedteknikker til trypsinisering baseret på de temperaturer, der anvendes under proceduren. De er varm og kold trypsinisering. Varm trypsinisering udføres ved 37 0C, hvorimod kold trypsinisering udføres under iskolde forhold. Selvom kold trypsinisering tager længere tid at fuldføre, siges det at have et højere udbytte af levedygtige celler. Dette skyldes det faktum, at celleskade minimeres ved kold trypsinisering, da den ikke bruger kraftige centrifugeringstrin. Dette er forskellen mellem varm og kold trypsinisering.
