Nøgleforskel – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green og Taqman er to metoder, der anvendes til at detektere eller se forstærkningsprocessen af real-time PCR. SYBR Green er en metode baseret på interkalerende nukleinsyrefarvningsfarve, mens Taqman er en metode baseret på hydrolyseprobe. Begge teknologier er designet til at generere fluorescens under PCR, hvilket gør det muligt for real-time PCR-maskine at overvåge reaktionen i "re altid". SYBR Green-metoden udføres ved hjælp af et fluorescerende farvestof kaldet SYBR green og detekterer amplifikationen ved at binde farvestoffet til produceret dobbeltstrenget DNA. Taqman udføres under anvendelse af dobbelt-mærkede prober og detekterer amplifikationen ved nedbrydning af proben med Taq-polymerase og frigivelser af fluoroforen. Dette er den vigtigste forskel mellem SYBR Green og Taqman.
Hvad er SYBR Green?
SYBR Grøn er et fluorescerende farvestof, der bruges til at farve nukleinsyrer, især dobbeltstrenget DNA i molekylærbiologi. SYBR Grøn metode bruges til at kvantificere PCR-produkter under re altids-PCR. Når først det binder med DNA, absorberer det resulterende DNA-farvekompleks blåt lys og udsender intenst grønt lys. Det sker på grund af den strukturelle ændring, der sker i farvestofmolekylet ved binding med dobbeltstrenget DNA. Når PCR skaber mere og mere DNA, binder flere farvestofmolekyler til DNA, hvilket genererer mere fluorescens. Derfor stiger fluorescensen med PCR-produktakkumuleringen. Mængden af PCR-produkt kan derfor måles kvantitativt ved hjælp af SYBR Green fluorescensdetektion.
SYBR grønt farvestof kan også bruges til DNA-mærkning i cytometri og fluorescensmikroskopi. Ethidiumbromid er med succes blevet erstattet af SYBR Green, da ethidiumbromid er et kræftfremkaldende farvestof med bortskaffelsesproblemer under DNA-visualisering i gelelektroforesen.
Der er fordele og ulemper ved SYBRs grønne metode. Denne metode er meget følsom, billig og nem at bruge. På grund af dets evne til at binde til et hvilket som helst dobbeltstrenget DNA, kan uspecifik binding imidlertid føre til overkvantificering af PCR-produkt.
Figur 01: SYBR Green Technique
Hvad er Taqman?
Taqman er en alternativ metode til SYBR Green til at overvåge PCR-processen i re altid. Denne metode afhænger af 5'-3' exonukleaseaktiviteten af Taq polymerase enzym for at nedbryde proberne under forlængelsen af den nye streng og frigivelsen af fluorofor. Dobbelt-mærkede prober anvendes i denne metode, og den er baseret på hydrolyse af prober. Prober er fluorescensmærkede DNA-oligonukleotider med et fluorescerende reportermolekyle (fluorofor) i 5'-enden og et quencher-molekyle i 3'-enden. De er designet til at binde til den enkeltstrengede skabelon på den modsatte side af primer-annealerne. Taq-polymerase tilføjer nukleotider til primeren og udvider den nye streng mod de dobbelt-mærkede prober. Når først Taq-polymerasen møder proben, aktiverer og nedbryder exonukleasevirkningen af Taq-polymerasen proben. Når den er færdig med syntesen af den nye streng, udsættes proben for fuldstændig nedbrydning og frigiver fluoroforen. Frigivelsen af fluorofor genererer fluorescens. Fluorescerende Quencher-molekyle slukker effektivt det udsendte lys og skaber output til kvantificering af PCR-produktet. Frigivelsen af fluoroforer og mængden af PCR-produkterne er proportional. Kvantificering kan derfor nemt udføres ved hjælp af Taqman-metoden.
Figur 02: Taqman-metode
Taqman-metoden bruges i real-time PCR, kvantificering af genekspression, påvisning af genetiske polymorfismer, kvantificering af kromosomale DNA-deletioner, bakteriel identifikation, verifikation af mikroarray-analyse, SNP-genotypning osv.
Hvad er forskellen mellem SYBR green og Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Grøn er baseret på DNA-bindende farvestof. | Taqman er afhængig af hybridiseringsprober og 5' til 3' exonukleaseaktivitet af Taq-polymerase. |
| Fluorescerende mærkede prober | |
| Ingen fluorescensmærkede prober er ikke påkrævet. | Dobbelt-mærkede prober er påkrævet. |
| Multiplex genanalyse | |
| Den kan ikke bruges til multipleks-genmål. | Den kan bruges til multiplekse genmål. |
| Pris | |
| Dette er billigere. | Dette er dyrere. |
| Specificity | |
| Dette er mindre specifikt og binder med ethvert dobbeltstrenget DNA | Disse er meget specifikke, da prober detekterer de specifikke amplifikationsprodukter. |
| Effektivitet | |
| Dette er mindre effektivt. | Dette er yderst effektivt. |
| Application | |
| Dette bruges i real-time PCR, visualisering af agarosegel, DNA-mærkning osv. | Dette bruges i real-time PCR, kvantificering af genekspression, påvisning af genetiske polymorfismer osv. |
Oversigt – SYBR Green og Taqman
Taqman og SYBR green er to metoder, der anvendes i real-time PCR (kvantitativ PCR). Begge metoder muliggør kvantificering af PCR-produktet effektivt og er afhængige af emissionen af fluorescensen. Taqman-metoden bruger dobbelt-mærkede prober til påvisning af det akkumulerede DNA, mens SYBR Green-metoden bruger et fluorescerende farvestof. Begge disse metoder har også forskellige anvendelser inden for molekylærbiologi.
