Nøgleforskel – Kloning vs Subkloning
Kloning og subkloning er molekylærbiologiske procedurer, som skaber genetisk identiske celler eller organismer, der bærer det DNA eller genet, som er af interesse. Kloning er en teknik, som involverer indsættelse af det interesserede gen eller DNA i en vektor, replikation af det i en værtsbakterie og produktion af celler eller organismer, som er nøjagtige kopier af den genetiske sammensætning. Subkloning er en teknik, der involverer indsættelse af genet af interesse, som allerede er indsat i en vektor, i en sekundær vektor, replikation af det i en værtsbakterie og produktion af genetisk identiske kopier af celler eller organismer. Den vigtigste forskel mellem kloning og subkloning er, at ved kloning fortsætter genet af interesse, når det er ligeret ind i en vektor, kloningsprocessen, mens det allerede klonede gen af interesse i subkloningen adskilles fra modervektoren og indsættes igen i en modtagervektor og fortsæt processen.
Hvad er kloning?
Kloning er den procedure, der producerer genetisk identiske organismer eller celler. I naturen sker kloning ved aseksuel reproduktion. Når der ikke er nogen genetisk rekombination eller ændring, modtager datterceller den samme genetiske sammensætning som forælderen. Prokaryote og eukaryote organismer skaber kloner ved binær fission, knopskydning, mitose osv. I molekylærbiologi er kloning af gener eller specifikke fragmenter af DNA en populær metode til at studere strukturen og funktionen af den pågældende DNA-sektion.
Hovedformålet med molekylær kloning er at lave millioner af kopier af genetisk identiske celler eller organismer, der bærer DNA-fragmentet af interesse (hovedsageligt gener). Det skaber organismer med nøjagtige genetiske kopier af en anden. Primært klones specifikke gener i molekylære undersøgelser for at opnå strukturel og funktionel information og til DNA-sekventering. Også til produktion af specifikke proteiner eller produkter i stor skala anvendes kloning i vid udstrækning.
kloningsprocedure
De grundlæggende trin i kloningsproceduren er som følger.
- Identifikation og isolering af genet af interesse. (Amplifikation af genet af interesse ved PCR).
- Restriktionsfordøjelse af genet af interesse (restriktionsendonuklease skar genet).
- Restriktionsfordøjelse af vektor-DNA'et. (Vektor-DNA skæres også ved hjælp af den samme restriktionsendonuklease).
- Indsættelse af genet i vektoren og dannelse af det rekombinante molekyle.
- Transformation af den rekombinante vektor til en værtsbakterie.
- Isolering og identifikation af de transformerede bakterier (plasmidvektor bør indeholde et selekterbart gen, oftest et antibiotikaresistensgen til at screene transformerede bakterier).
- Rekombinant genekspression i værten.
Figure_01: Kloningsprocedure
Hvad er subkloning?
Subkloning er en procedure til at flytte et gen af interesse fra en vektor til en anden vektor for at se genets ekspression for at opnå den ønskede funktionalitet af genet. I denne metode er to vektorer involveret; nemlig overordnet vektor og destinationsvektor. Klonede inserts flyttes igen ind i en anden vektor i subkloning. Formålet med at overføre genet fra den første vektor til den anden vektor er at opnå noget, som ikke kunne gøres af den første vektor, eller at adskille et gen igen i det allerede klonede fragment af DNA og udtrykke det alene. Restriktionsenzymer bruges i denne procedure i begyndelsen.
Subkloningsprocedure
De grundlæggende trin i subkloning er som følger.
- Ved hjælp af restriktionsendonukleaser, adskillelse af DNA'et af interesse i donorplasmidet (modervektor).
- Amplifikation af DNA'et af interesse ved hjælp af PCR.
- Oprensning af PCR-produktet (DNA af interesse) ved gelelektroforese.
- Åbning af modtagerplasmidet med samme restriktionsendonukleaser, der bruges til at adskille DNA af interesse i moderplasmidet.
- Ligering af DNA'et af interesse (gen) i modtagerplasmidet for at skabe det subklonede plasmid.
- Transformation af den subklonede vektor til en kompetent værtsbakterie.
- Screening af transformerede celler.
- Oprensning af plasmid-DNA'et og brug til DNA-sekventering eller ekspression af generne for at opnå de ønskede produkter.
Subkloning udføres ved lejligheder til isolering af ét gen fra den klonede gruppe af gener, eller når genet af interesse skal overføres til et nyttigt plasmid for at se den nøjagtige funktion af genet af interesse.
Figure_02: Subkloningsprocedure
Hvad er forskellen mellem kloning og subkloning?
Kloning vs Subcloning |
|
| Kloning er den procedure, der producerer genetisk identiske organismer eller celler. | Subkloning er en procedure til at flytte et gen af interesse fra en vektor til en anden vektor for at se genets ekspression for at opnå den ønskede funktionalitet af genet. |
| Process | |
| Separer DNA'et af interesse fra organismen og indsættes i en vektor én gang og klones | Allerede klonet DNA separeres fra den første vektor og indsættes i en anden vektor og klones. |
| Indsæt bevægelse via vektorer | |
| Flytter ikke inserts (DNA af interesse) fra en vektor til en anden vektor. | Flyt indstik fra overordnet vektor til destinationsvektor. |
Oversigt – Kloning vs Subkloning
Kloning skaber genetisk identiske celler eller organismer med det indsatte gen eller DNA af interesse. Det fortsætter gennem separation og indsættelse af DNA'et af interesse i en vektor og ekspression i en værtsbakterie. Subkloning deler lignende trin med kloning. Ved subkloning indsættes imidlertid allerede klonet DNA-fragment (gen af interesse) i en vektor og transformeres til en værtsbakterie. Det er den vigtigste forskel mellem kloning og subkloning.
