PCR vs Real-time PCR
PCR eller Polymerase-kædereaktion er en revolutioneret opdagelse i moderne molekylærbiologi, som først blev udviklet af kemikeren Kary Mullis i 1983. Den tillader en enkelt sekvens i et komplekst DNA at blive amplificeret til analyse. Den grundlæggende idé med PCR er, at to primere, som er komplementære til de modsatte strenge af en DNA-sekvens, er orienteret mod hinanden; primerne producerer komplementære strenge, der hver indeholder den anden primer. Derfor er resultatet en stor mængde af en sekvens svarende til det DNA, der ligger mellem de to primere. DNA-polymeraseenzym bruges til at forlænge primerne i PCR. DNA-polymerase er et termostabilt enzym, og det har evnen til at overleve i høje temperaturer (94 til 95 °C), der bruges til denaturering af template-DNA.
PCR'en involverer tre trin, nemlig gentagne runder af denaturering, annealing af primere og syntese af DNA. En thermocycler-maskine bruges til at udføre denne reaktion, så den kan programmeres til at ændre temperaturerne hurtigt og præcist. Anvendelser af PCR er kriminel efterforskning, DNA-fingeraftryk, påvisning af patogener og analyse af DNA fra tidlige menneskearter.
Hvad er konventionel PCR?
Der er tre hovedstadier af konventionel PCR, nemlig; DNA-amplifikationstrin, separation af PCR og påvisning af produkter. Adskillelse af DNA-segmenter udføres typisk ved agarosegelelektroforese. Produkterne farves derefter med etheiduimbromid. Endelig opnås detektion ved visualisering af bånd på geler under UV-lys. Derfor er de endelige resultater af konventionel PCR ikke udtrykt som tal. Norm alt er den konventionelle PCR kun i stand til at detektere en enkelt parameter.
Hvad er re altids-PCR?
Real-time PCR kan detektere amplifikation af produkter, efterhånden som produkterne syntetiseres. Med udviklingen af teknologien er PCR blevet en meget populær teknik, især til påvisning og identifikation af bakterier i fødevarer. Re altids-PCR'en bruger et fluorescerende farvesystem og termocykler udstyret med fluorescerende-detektionsevne.
Hvad er forskellen mellem konventionel PCR og re altids-PCR?
• Konventionel PCR er mere tidskrævende, da den bruger gelelektroforese til at analysere de amplificerede PCR-produkter. I modsætning hertil er re altids-PCR mindre tidskrævende, da den kan detektere forstærkninger i de tidlige faser af reaktionen.
• Re altids-PCR indsamler data ved den eksponentielle vækstfase af PCR, mens traditionel PCR indsamler data ved reaktionens slutpunkt.
• Slutpunktsresultaterne for den konventionelle PCR er muligvis ikke særlig præcise, men resultaterne af re altids-PCR'en er meget præcise.
• Re altids-PCR er mere følsomt end konventionel PCR.
• Konventionel PCR har meget dårlig opløsning, mens PCR i re altid kan registrere meget få ændringer på grund af den høje opløsning.
• Slutpunktsdetektion af konventionel PCR har kort dynamisk rækkevidde, mens PCR-detektion i re altid har bredt dynamisk område.
• I modsætning til konventionel PCR findes automatiserede detektionsteknikker i real-time PCR.
• Konventionel PCR er meget sofistikeret og arbejdskrævende mere end real-time PCR.
• I modsætning til re altids-PCR kan konventionel PCR ikke skelne mellem døde og levende bakterier.
• Real-time PCR bruger et fluorescerende farvesystem til at detektere produkterne, mens konventionel PCR bruger ethidiumbromid og UV-lys til at visualisere bånd i agarosegelmediet.
