Nøgleforskellen mellem konventionelle indlejrede og re altids-PCR-assays er, at konventionel PCR er en teknik udviklet til at amplificere specifikke DNA-sekvenser, og indlejret PCR er en modifikation af konventionel PCR, der består af to sekventielle amplifikationsreaktioner, mens reelle -time PCR er en variant af konventionel PCR, der er i stand til at kvantificere det amplificerede produkt.
PCR er en meget almindelig videnskabelig teknik, der er meget brugt i forskning og medicin til at påvise DNA. PCR-test bruges til at påvise antigener ved at påvise deres DNA eller RNA. Generelt er vir alt RNA til stede i kroppen, før det påvises antistoffer eller viser symptomerne på sygdommen. En PCR-test kan fortælle, om nogen har virussen tidligt eller ej. I øjeblikket er PCR standardtesten til påvisning af COVID-19 sygdom. Der er forskellige typer PCR-teknikker, såsom real-time PCR, indlejret PCR, multiplex PCR, hotstart PCR og langdistance PCR osv.
Hvad er konventionelle PCR-analyser?
Konventionel PCR-assay er en in vitro DNA-amplifikationsteknik, der rutinemæssigt udføres i molekylærbiologiske laboratorier. Denne metode gjorde det muligt at fremstille tusinder til millioner af kopier af et bestemt DNA-fragment. Kary Mullis introducerede denne teknik i 1980. Denne teknik kræver et DNA-fragment kendt som skabelonen for at kunne lave mange kopier af det. Taq-polymerase fungerer som DNA-polymerase-enzymet og katalyserer syntesen af nye strenge i skabelonsekvensen.
Primere i PCR-blandingen vil fungere som udgangspunkt for fragmentudvidelserne. Alle de ingredienser, der er nødvendige for at lave kopier af DNA, er inkluderet i PCR-blandingen. PCR-reaktion køres i en PCR-maskine, og den skal fodres med den korrekte PCR-blanding og det korrekte PCR-program. Hvis reaktionsblandingen og programmet er korrekte, vil det producere det nødvendige antal kopier af en bestemt del af DNA fra en meget lille mængde DNA.
Figur 01: Konventionel PCR-analyse
Der er tre hovedtrin involveret i en PCR-reaktion: denaturering, primer-annealing og strengforlængelse. Disse tre trin forekommer ved tre forskellige temperaturer. PCR-buffer opretholder de optimale betingelser for Taq-polymerasevirkningen. Disse tre trin af PCR-reaktionen gentages for at producere den nødvendige mængde af PCR-produktet. Ved hver PCR-reaktion fordobles antallet af DNA-kopier. Derfor kan eksponentiel amplifikation observeres i PCR. PCR-produkt kan opløses ved hjælp af gelelektroforese, da det producerer en synlig mængde DNA på en gel, og det kan oprenses til yderligere undersøgelser såsom sekventering.
PCR er et værdifuldt værktøj inden for medicinsk og biologisk forskning. Især i retsmedicinske undersøgelser har PCR en enorm værdi, da den kan forstærke DNA til undersøgelser fra de små prøver af de kriminelle og lave retsmedicinske DNA-profiler. PCR er meget udbredt inden for mange områder af molekylærbiologi, herunder genotypebestemmelse, genkloning, mutationsdetektion, DNA-sekventering, DNA-mikroarrays og faderskabstestning.
Hvad er Nested PCR-assays?
Nested PCR er en type PCR, der reducerer den ikke-specifikke amplifikation af DNA. Der er to på hinanden følgende PCR'er eller to sekventielle amplifikationsreaktioner i nestet PCR-assay. Under den første amplifikationsreaktion produceres et PCR-produkt. Efter den første reaktion udføres en anden amplifikationsreaktion på PCR-produktet fra den første reaktion. Derfor binder primere i den anden reaktionsblanding til det første PCR-produkt og amplificerer det.
Figur 02: Indlejret PCR
Primerpar er forskellige i hver reaktion. Den ikke-specifikke binding af primere reduceres i indlejret PCR. Indlejrede PCR-assays er nyttige til at øge sensitiviteten og/eller specificiteten. Indlejret PCR kræver dog viden om den interesserede sekvens.
Hvad er re altids-PCR-analyser?
Real-time PCR eller kvantitativ PCR (Q PCR) er en modificeret version af PCR, der måler PCR-produkterne kvantitativt. Derfor kvantificerer denne teknik amplifikationen i re altid ved hjælp af en real-time PCR-maskine. Det er også en egnet metode til at bestemme mængden af en målsekvens eller gen til stede i en prøve.
Det interessante træk ved real-time PCR er, at den kombinerer både amplifikation og ægte kvantificering i et enkelt trin. Derfor kan behovet for gelelektroforese til detektion elimineres ved real-time PCR-teknikken. Brugen af fluorescerende farvestoffer til at mærke PCR-produkter under PCR-reaktionerne vil i sidste ende føre til direkte kvantificering. Når PCR-produkterne akkumuleres, akkumuleres de fluorescerende signaler også, og de vil blive målt af re altidsmaskinen. SYBR Green og Taqman er to metoder til at detektere eller se amplifikationsprocessen af real-time PCR. Begge metoder overvåger forløbet af amplifikationsprocessen og rapporterer mængden af produktet i re altid.
Figur 03: Re altids-PCR
PCR i re altid har en bred vifte af anvendelser, såsom kvantificering af genekspression, mikroRNA og ikke-kodende RNA-analyse, SNP-genotypning, påvisning af kopiantalvarianter, påvisning af sjældne mutationer, påvisning af genetisk modificerede organismer og påvisning af smitsomme stoffer.
Hvad er lighederne mellem konventionelle indlejrede og re altids-PCR-analyser?
- Indlejrede og re altids-PCR-analyser er modifikationer af konventionel PCR-analyse.
- Alle tre teknikker amplificerer DNA-prøver.
- Deres produkter kan bruges i sekventering eller analyse.
- Disse analyser kræver primere.
Hvad er forskellen mellem konventionelle indlejrede og re altids-PCR-analyser?
Konventionel PCR er en teknik udviklet til at amplificere specifikke DNA-sekvenser. I mellemtiden er Nested PCR en modifikation af konventionel PCR, der består af to sekventielle amplifikationsreaktioner, og real-time PCR er en variant af konventionel PCR, der er i stand til at kvantificere det amplificerede produkt. Så dette er den vigtigste forskel mellem konventionelle indlejrede og re altids-PCR-assays. I modsætning til konventionel og re altids-PCR bruger indlejret PCR to primersæt. Desuden er der to successive amplifikationsreaktioner i indlejret PCR for at reducere ikke-specifik amplifikation. desuden indeholder de konventionelle og re altids-PCR-analyser ikke to sekventielle amplifikationsreaktioner.
Den følgende infografik viser forskellene mellem konventionelle indlejrede og re altids-PCR-analyser i tabelform til sammenligning side om side.
Opsummering – Konventionelle vs. indlejrede vs. re altids-PCR-analyser
Konventionel PCR er den første teknik udviklet til at amplificere specifikke fragmenter af DNA. Nested PCR og real-time PCR er to varianter af konventionel PCR. Der er to sekventielle amplifikationsreaktioner og brugen af to primersæt i indlejret PCR. Real-time PCR er udviklet til at kvantificere det amplificerede PCR-produkt. Dette opsummerer således forskellen mellem konventionelle indlejrede og re altids-PCR-assays.
