Nøgleforskel – Nitrocellulose vs PVDF
Western blotting er en metode, der tillader detektion og kvantificering af specifikke proteiner fra en proteinprøve. Pålideligheden af teknikken afhænger af valget af en korrekt membran til absorption af proteiner fra gelen. Der findes forskellige typer mikroporøse membraner. Nitrocellulose- og PVDF-membraner er to sådanne membraner, som forskerne foretrækker på grund af deres særlige egenskaber frem for de andre typer membraner. Udvælgelsen mellem nitrocellulose eller PVDF er også en anden udfordring i western blotting. Både nitrocellulose og PVDF har en høj proteinabsorptionskapacitet. Den vigtigste forskel mellem nitrocellulose og PVDF-membran er, at nitrocellulosemembraner ikke har evnen til at fjerne antistoffer og genbruge membranen til antistof-reprobing, mens PVDF-membraner har stripping- og genbrugsevne.
Hvad er nitrocellulose?
Nitrocellulose er en polymer fremstillet ved at behandle cellulose med salpetersyre og bruges til at lave mikroporøse membraner i molekylærbiologi, især til blotting-teknikker såsom southern, northern og western blotting. Porestørrelser af nitrocellulosemembraner varierer fra 3 til 20 µm. Nitrocellulose mikroporøse membraner letter påvisningen af immunokemiske reaktioner, der sker på overfladen af membranen. Derfor bruges nitrocellulosemembraner ofte til immobilisering af proteiner og påvisning af specifikke proteiner i western blotting. Nitrocellulosemembraner kan også immobilisere glykoproteiner og nukleinsyrer.
Nitrocellulosemembraner foretrækkes i lateral flow-assays på grund af flere funktioner. Nitrocellulosemembraner absorberer proteiner i en høj koncentration. Opløsningsmidlet, der bruges til at fugte membranen, formindsker ikke nitrocellulosemembranens proteinabsorption. Nitrocellulosemembraner kan let skæres til den ønskede gelstørrelse og overføre proteiner fra gelen til membranen ved elektrisk eller kapillær overførsel. Nitrocellulose tillader hurtigere flow af proteiner gennem membranen med højt bindingspotentiale. Nitrocellulose viser en forbedret håndteringsstyrke. En anden speciel egenskab ved nitrocellulosemembran er, at den let kan limes med ikke-opløsningsmiddel vandfast klæbemidler på forskellige plastikbagsider.
Figur 01: Nitrocellulosemembran til western blotting
Hvad er PVDF?
Polyvinylidendifluorid (PVDF) er fluorpolymer fremstillet ved polymerisation af vinylidendifluorid og har en høj immobiliseringsevne af proteiner. Derfor bruges mikroporøse membraner fremstillet af PVDF i western blotting-teknikker til at analysere specifikke proteiner fra blandingerne af proteiner. PVDF-membraner kan også bruges til aminosyreanalyse og proteinsekventering. Den vigtigste egenskab ved PVDF-membran frem for nitrocellulosemembran er, at den let kan fjernes fra antistofferne og genbruges til efterfølgende antistofprober.
PVDF-membraner er tykkere end nitrocellulosemembraner; dermed mere modstandsdygtig over for skader under genbrug. PVDF-membraner er meget hydrofobe. Derfor skal de lægges i blød i methanol eller isopropanol før brug.
Hvad er forskellen mellem nitrocellulose og PVDF?
Nitrocellulose vs. PVDF |
|
| Nitrocellulose er en polymer sammensat af cellulose. | PVDF er en fluorpolymer fremstillet ved polymerisation af vinylidendifluorid. |
| Membranporestørrelse | |
| Typiske porestørrelser er 0,1, 0,2 eller 0,45μ | Typiske porestørrelser er 0,1, 0,2 eller 0,45μm |
| Proteinbindingskapacitet | |
| Nitrocellulose har en proteinbindingskapacitet på 80 til 100 μg/cm2. | PVDF har en proteinbindingskapacitet på 170 til 200 μg/cm2. |
| Følsomhed | |
| Dette har en lav følsomhed sammenlignet med PVDF. | Dette har en høj følsomhed. |
| Detektion af lavt udtrykte proteiner | |
| Da følsomheden er lav i nitrocellulosemembraner, er den ikke egnet til påvisning af lavt udtrykte proteiner. | Dette er mere velegnet til påvisning af lavt udtrykte proteiner på grund af dets høje følsomhed. |
| Baggrundsstøj | |
| Dette har lavere baggrundsstøj | Dette har højere baggrundsstøj. |
| Interaktioner med proteiner | |
| Proteinmolekyler binder sig til nitrocellulosemembraner gennem hydrofobe interaktioner. | Proteiner binder til PVDF-membraner gennem hydrofobe og dipol-interaktioner. |
| Membranens natur | |
| Nitrocellulose er skørt og skrøbeligt. Der findes dog versioner af nitrocellulose, og de er resistente. | PVDF er mere holdbar og har højere kemisk resistens. |
| Evne til at strippe og genbruge | |
| Nitrocellulose kan have svært ved at strippe og genprobe uden at miste signalet. | PVDF er ideel til reprobing og sekventering af applikationer. |
| Egnethed | |
| Nitrocellulose er ideel til påvisning af lavmolekylære proteiner. | PVDF er mere velegnet til at detektere proteiner med højere molekylvægt. |
| Anden brug | |
| Nitrocellulose kan bruges til nukleinsyreanalyse og dot/slot blotting. | PVDF kan bruges til proteinsekventering og fastfase-assaysystemer. |
| Pris | |
| Dette er billigere end PVDF-membraner. | Dette er dyrere end nitrocellulosemembraner. |
| Need for Pre-wetting | |
| Nitrocellulosemembraner kræver ikke iblødsætning med methanol | PVDF-membraner kræver iblødsætning med methanol. |
Opsummering – Nitrocellulose vs PVDF
Nitrocellulosemembraner var de første membraner, der blev brugt kommercielt til lateral flow-assay. De har en høj kapacitet til at absorbere proteiner. Derfor bruges nitrocellulosemembraner til western blotting. PVDF er en anden type membran, der bruges i western blotting, og den har også en høj proteinabsorptionskapacitet. Begge typer bruges i western blotting til proteinanalyse. PVDF-membraner har dog flere specielle egenskaber, hvilket gør dem mere velegnede end nitrocellulosemembraner til western blotting. Men nitrocellulosemembraner er mere egnede til påvisning af lavmolekylære proteiner, PVDF-membraner er mere egnede til påvisning af højmolekylære proteiner. Dette er forskellen mellem nitrocellulose- og PVDF-membraner.
