Nøgleforskel – Phusion vs Taq Polymerase
DNA-polymeraser er meget udbredte enzymer i molekylærbiologiske teknikker og er også naturligt til stede i alle organismer, der gennemgår DNA-replikation. De er de vigtigste polymeriserende enzymer, der involverer under replikation. DNA-polymerase er i stand til at tilføje nukleotider til den frie 3'-ende af DNA-strengen og derved forårsage forlængelse af en ny streng. På nuværende tidspunkt er det på grund af udviklingen inden for molekylærbiologi inden for sygdomsdiagnostik og industrielle anvendelser vigtigt at fremstille polymeraser med forskellige gavnlige egenskaber. Dette øger nøjagtigheden af metoden og gør den til en hurtigere teknik. Phusion og Taq polymerase er to kommercielt fremstillede termostabile polymeraseenzymer, der bruges i specielle molekylære applikationer. Phusion er en DNA-polymerase isoleret fra Pyrococcus furiosus og bruges hovedsageligt i kloningseksperimenter for at øge troskaben. Taq DNA-polymerase er standard-DNA-polymerase, der bruges i polymerasekædereaktionen (PCR), og den er isoleret fra den termostabile bakterie; Thermus aquaticus. Den vigtigste forskel mellem de to enzymer er kildemikroorganismen. Phusion er isoleret fra den ekstremofile, Pyrococcus furiosus, hvorimod Taq-polymerase er isoleret fra den termofile, Thermus aquaticus.
Hvad er Phusion?
Phusion DNA-polymerase er en ny polymerase, der fremstilles ved at isolere enzymet fra Pyrococcus furiosus, som er en ekstremofil Archaea. Disse mikrober opholder sig under ekstremt høje temperaturforhold og gør derved polymerasen til en meget varmestabil polymerase. Phusion polymerase bruges til at opnå ekstrem troskab i forhold til den konventionelle termostabile polymerase; Taq polymerase. Phusionpolymerase er i stand til at amplificere lange skabeloner op til 7,5 kb genomisk DNA. Den optimale polymerisationskapacitet for Phusion-polymerase er ved 720 C. Phusion bruges også i kloningsprodukter til sekventering, ekspressionsanalyse og mutationsanalyse.
Phusion DNA-polymerase har 3'-5' exonukleaseaktiviteten. Dette muliggør korrekturlæsning af den nyligt syntetiserede streng efter syntesen. Derfor kan nukleotid-fejlparringen let repareres. Den har således en mindre fejlrate. Overordnede fordele ved Phusion polymerase er;
- Extreme Fidelity
- Høj hastighed og reduceret forlængelsestid
- Robuste reaktioner og kræver minimal optimering
- Højt udbytte
Figur 01: Phusion
Den største ulempe ved Phusion-polymerase er, at den hæmmes i nærvær af deoxyuridintrifosfat (dUTP). Når dUTP'er akkumuleres i reaktionsblandingen, kan det hæmme virkningerne af Phusion-polymerase. Dette forhindres ved at behandle reaktionsblandingen med dUTPase før tilsætning af enzymet. På nuværende tidspunkt bruges en dUTP-resistent variant af Phusion-polymerase kendt som Pfu Turbo i stedet for Phusion-polymerase som en løsning på dette problem.
Hvad er Taq Polymerase?
Taq DNA-polymerase-opfindelsen har revolutioneret området for molekylærbiologi. Det løste et stort problem i DNA-amplifikation. Taq DNA-polymerase er et varmestabilt polymeraseenzym ekstraheret og isoleret fra den termofile bakterie, Thermus aquaticus. Opdagelsen af disse enzymer fører til udviklingen af PCR. Dette enzym har tilladt anvendelsen af polymerasekædereaktion i DNA-amplifikation i stedet for konventionelle besværlige kloningsteknikker. PCR bruges nu inden for molekylær diagnostik, landbrug og industri, med mange nye variationer tilføjet til teknikken.
Figur 02: Taq Polymerase
Taq DNA-polymerase fungerer ved det optimale temperaturområde mellem 720C – 800C. Taq DNA-polymerase kræver en co-faktor; magnesium for dets funktion. Taq-polymerase har ikke 3'-5'-korrekturlæseevnen, derfor er fejlraten for Taq DNA-polymerase høj sammenlignet med nyere typer DNA-polymeraser såsom Phusion-polymerase osv. Men populariteten af Taq DNA-polymerase er fortsat den det samme i hele videnskabens verden på grund af enzymets bekvemmelighed og fleksibilitet.
Hvad er lighederne mellem Phusion og Taq-polymerase?
- Både Phusion- og Taq-polymerase-enzymer er polymeriserende enzymer, der er i stand til at tilføje nukleotider til den 3' frie ende af DNA-strengen.
- Både Phusion- og Taq-polymeraser kræver en primersekvens for at initiere polymerisation.
- Både Phusion- og Taq-polymeraser er varmestabile.
- Både Phusion- og Taq-polymeraser bruges i PCR-mekanismer til at amplificere DNA.
- Når polymerasen tilsættes til reaktionsblandingen, tilsættes både Phusion- og Taq-polymeraser sidst for at sikre enzymets effektivitet.
- Både Phusion- og Taq-polymeraser syntetiseres kommercielt til molekylærbiologiske eksperimentelle formål.
- Både Phusion- og Taq-polymeraser kræver en cofaktor for at fuldføre dens funktion.
Hvad er forskellen mellem Phusion og Taq Polymerase?
Phusion vs Taq Polymerase |
|
| Phusion er en DNA-polymerase isoleret fra Pyrococcus furiosus og bruges hovedsageligt i kloningseksperimenter for at øge troskaben. | Taq DNA-polymerase er standard-DNA-polymerase, der anvendes i Polymerase Chain Reaction (PCR), og den er isoleret fra den termostabile bakterie, Thermus aquaticus. |
| Kildeorganisme | |
| Phusion er udvundet fra ekstremofile archaea – Pyrococcus furiosus. | Disse litterære værker spænder fra koloniseringsperioden til afkoloniseringsperioden. |
| korrekturlæseevne | |
| 3’ – 5’ korrekturlæsningsevne er til stede i Phusion. | 3’ – 5’ korrekturlæseevne er fraværende i Taq-polymerase. |
| Fidelity | |
| High fidelity er der med Phusion. | Taq-polymerase viser lav kvalitet. |
| Amplification | |
| Phusion er i stand til at amplificere lange DNA-fragmenter. | Taq-polymerase er i stand til at amplificere meget kortere DNA-fragmenter. |
| dUTP-forgiftning | |
| Phusion-handling er hæmmet af ulige akkumulering. | Taq-polymerase hæmmes ikke af dUPT. |
Opsummering – Phusion vs Taq-polymerase
Phusion og Taq DNA-polymerase er to varmestabile polymeraser, der bruges i PCR-teknikker. Phusion er en polymerase isoleret fra den ekstremofile Pyrococcus furiosus, hvorimod Taq er isoleret fra den termostabile bakterie Thermus aquaticus. Opdagelse af Taq DNA-polymerase fører til PCR-opfindelsen. Phusion har mange fordele i forhold til Taq, der har gjort Phusion til en bedre mulighed for at producere high fidelity DNA. Imidlertid bruges Taq-polymerase stadig som standardpolymeraseenzym i PCR. Dette er forskellen mellem Phusion og Taq polymerase.
