Nøgleforskel – PCR vs DNA-replikation
DNA-replikation er en naturlig proces, der forekommer i levende organismer. Det involverer produktion af to identiske kopier af et DNA-molekyle. DNA-replikation er en ekstremt vigtig proces for biologisk arv. Genetisk information overføres fra forælder til afkom hovedsageligt på grund af evnen til DNA-replikation. Derfor er det en væsentlig proces, der forekommer i næsten alle levende organismer. Denne proces sker in vivo. DNA-replikation kan dog også udføres via in vitro-metoder. Polymerase Chain Reaction (PCR) er en sådan in vitro-metode til DNA-replikation. PCR er en DNA-amplifikationsmetode udført i laboratorier. Den producerer tusinder til millioner af kopier af DNA fra et interesseret DNA-fragment eller et gen. Der er forskelle mellem in vivo DNA-replikation og PCR. Den vigtigste forskel mellem disse to er, at PCR udføres i en PCR-maskine ved fastholdte temperaturer for at producere et stort antal kopier af DNA, mens DNA-replikation sker inde i kroppen ved kropstemperatur for at producere to identiske kopier af et enkelt DNA-molekyle.
Hvad er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en in vitro DNA-amplifikationsteknik, der rutinemæssigt udføres i molekylærbiologiske laboratorier. Denne metode gjorde det muligt at fremstille tusinder til millioner af kopier af et særligt interesseret DNA-fragment. PCR blev introduceret af Kary Mullis i 1980. I denne teknik tjener det interesserede fragment af DNA som skabelonen til at lave kopier. Enzymet kaldet Taq-polymerase bruges som DNA-polymerase-enzymet, og det vil katalysere syntesen af nye strenge af DNA-fragmentet. Primere, der er i PCR-blandingen, vil fungere som udgangspunkt for fragmentforlængelserne. Ved slutningen af PCR-reaktionen kan der opnås mange kopier af prøve-DNA'et.
Alle de ingredienser, der er nødvendige for at lave kopier af DNA, er inkluderet i PCR-blandingen. De er prøve-DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primere (fremadgående og omvendte primere), nukleotider (byggesten af DNA) og en buffer. PCR-reaktion køres i en PCR-maskine, og den skal fodres med korrekt PCR-blanding og det korrekte PCR-program. Hvis reaktionsblandingen og programmet er korrekte, vil det producere den nødvendige mængde kopier af en bestemt del af DNA fra en meget lille mængde DNA.
Der er tre hovedtrin involveret i en PCR-reaktion, nemlig denaturering, primer-annealing og strengforlængelse. Disse tre trin forekommer ved tre forskellige temperaturer. DNA eksisterer som en dobbeltstrenget helix. To strenge er bundet af hydrogenbindinger. Inden amplifikation adskilles dobbeltstrenget DNA ved at give en høj temperatur. Ved høj temperatur denatureres dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenge. Derefter annealer primerne med de flankerende ender af det interesserede fragment eller genet af DNA'et. Primer er et kort stykke enkeltstrenget DNA, der er komplementært til enderne af målsekvensen. Forward og reverse primere annealer med de komplementære baser ved de flankerende ender af det denaturerede prøve-DNA ved annealingstemperaturen.
Når primere anneales med DNA, initierer Taq-polymerase-enzym syntesen af de nye strenge ved at tilføje nukleotider, der er komplementære til template-DNA'et. Taq polymerase er et varmestabilt enzym, der er isoleret fra en termofil bakterie kaldet Thermus aquaticus. PCR-buffer opretholder de optimale betingelser for Taq-polymerasevirkningen. Disse tre trin af PCR-reaktionen gentages for at producere den nødvendige mængde af PCR-produktet. Ved hver PCR-reaktion fordobles antallet af DNA-kopierne. Derfor kan en eksponentiel amplifikation observeres i PCR. PCR-produkt kan observeres ved hjælp af gelelektroforese, da det producerer den synlige mængde DNA på en gel, og det kan oprenses til yderligere undersøgelser såsom sekventering osv.
Figur 01: PCR
PCR er et værdifuldt værktøj inden for medicinsk og biologisk forskning. Især i retsmedicinske undersøgelser har PCR en enorm værdi, da den kan forstærke DNA til undersøgelser fra de små prøver af de kriminelle og lave retsmedicinske DNA-profiler. PCR er meget udbredt inden for mange områder af molekylærbiologien, herunder genotypebestemmelse, genkloning, mutationsdetektion, DNA-sekventering, DNA-mikroarrays og faderskabstest osv.
Hvad er DNA-replikation?
DNA-replikation henvises til den proces, der producerer to identiske kopier af DNA fra ét DNA-molekyle. Det er en vigtig proces med biologisk arv. DNA-replikation forekommer i alle levende organismer. Modercellens genom bør replikeres for at overdrage genomet til dattercellen. DNA-replikationsprocessen har tre hovedtrin kaldet initiering, forlængelse og terminering. Disse trin katalyseres af forskellige enzymer. DNA-replikation starter fra det sted, der kaldes replikationsorigin i cellernes genom. I genomet eksisterer DNA i dobbeltstrenget form. Disse to strenge adskilles i begyndelsen af DNA-replikationen, og det udføres af ATP-afhængig DNA-helicase. Afviklingen af DNA er den vigtigste begivenhed, der finder sted i initieringstrinnet. Ved at bruge adskilte DNA-strenge som skabeloner syntetiserer DNA-polymerase de nye komplementære strenge af skabelonstrengene i 5' til 3' retning. Dette er det trin, der kaldes forlængelse. Afslutning sker, når de to replikationsgafler mødes med hinanden på den modsatte ende af forældrekromosomet.
Figur 02: DNA-replikation
Udover DNA-polymerase er flere enzymer såsom DNA-primase, DNA-helicase, DNA-ligase og Topoisomerase involveret i DNA-replikationen. Et særligt træk ved in vivo DNA-replikationen er, at den producerer Okazaki-fragmenter. Den ene tråd formes kontinuerligt, mens den anden dannes i små stykker.
Hvad er lighederne mellem PCR og DNA-replikation?
- I både PCR- og DNA-replikation adskilles dobbeltstrenget DNA fra hinanden.
- I både PCR- og DNA-replikationsprocesser kopieres DNA.
- Både PCR- og DNA-replikationsprocesser er virkelig vigtige.
- I både PCR- og DNA-replikationsprocesser er DNA-polymeraseenzym involveret.
Hvad er forskellen mellem PCR og DNA-replikation?
PCR vs DNA-replikation |
|
| PCR er en in vitro-metode til DNA-amplifikation, hvor der produceres tusinder til millioner af kopier af DNA. | DNA-replikation er en naturlig proces, der producerer to identiske kopier af DNA fra ét DNA-molekyle. |
| Trin | |
| PCR har tre trin; denaturering, primer-annealing og strengforlængelse. | DNA-replikation har tre trin; initiering, forlængelse og afslutning. |
| Involvering af primere | |
| PCR har brug for kunstige primere. | DNA-replikation behøver ikke kunstige primere. Et kort fragment af RNA er involveret i DNA-replikation. |
| Denaturering af dobbeltstrengene | |
| Dobbeltstrenge adskilles ved at anvende en høj temperatur i PCR. | Dobbeltstrenge er adskilt fra hinanden af enzymet DNA-helicase i DNA-replikation. |
| Enzyme Involved | |
| PCR bruger Taq-polymerase. | DNA-replikation bruger DNA-polymerase. |
| Temperature | |
| PCR forekommer ved tre forskellige temperaturer inde i en maskine. | DNA-replikation sker ved kropstemperatur i den levende organismes krop. |
| In vivo eller In vitro | |
| PCR er en in vitro-metode. | DNA-replikering er en in vivo-metode. |
Opsummering – PCR vs DNA-replikation
DNA-replikation er en proces til fremstilling af to identiske kopier af DNA fra et enkelt DNA-molekyle. Det forekommer i alle levende organismer, da det tilbyder en metode til at give den genetiske information fra forælder til afkom. Den består af tre enzymatisk katalyserede trin, nemlig initiering, forlængelse og terminering. DNA-replikation kan udføres kunstigt i laboratoriet. PCR er en måde at producere et stort antal kopier af DNA fra det interesserede DNA. PCR udføres rutinemæssigt i molekylærbiologiske laboratorier, da det er en nem metode til at fremstille kopier af DNA. Dette er forskellen mellem PCR og DNA-replikation.
