Nøgleforskel – PCR vs DNA-sekventering
PCR og DNA-sekventering er to vigtige teknikker i molekylærbiologi. Polymerase Chain Reaction (PCR) er den proces, der skaber et stort antal kopier af et DNA-fragment. DNA-sekventering er den teknik, der resulterer i den præcise rækkefølge af nukleotiderne i et givet DNA-fragment. Dette er den vigtigste forskel mellem PCR og DNA-sekventering. PCR er et af de vigtigste trin involveret i DNA-sekventering.
Hvad er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en DNA-amplifikationsteknik, der bruges i molekylærbiologi. Det producerer tusinder til millioner af kopier af et bestemt DNA-fragment. Denne metode blev udviklet af Kary Mullis i 1983. I denne teknik tjener det fragment af DNA, der skal amplificeres, som skabelonen, og DNA-polymeraseenzymet tilføjer komplementære nukleotider til primeren, som er tilgængelig i PCR-blandingen. Ved slutningen af PCR-reaktionen syntetiseres mange kopier af prøve-DNA'et.
Der er forskellige komponenter i PCR-blandingen, herunder DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primere (fremadgående og omvendte primere), nukleotider (byggesten af DNA) og en buffer. PCR sker inde i en PCR-maskine, og den korrekte PCR-blanding skal indlæses i maskinen, og det korrekte program skal køres. Denne teknik gør det muligt at fremstille tusinder til millioner af kopier af en bestemt del af DNA fra en meget lille mængde DNA.
PCR-reaktioner forekommer på en cyklisk måde for at producere den synlige mængde af PCR-produkter på en gel. Der er tre hovedtrin involveret i en PCR-reaktion, nemlig denaturering, primer-annealing og strengforlængelse som vist i figur 01. Disse tre trin finder sted ved tre forskellige temperaturer. DNA eksisterer i dobbeltstrenget form af hydrogenbindinger mellem de komplementære baser. Før implikation skal dobbeltstrenget DNA adskilles fra hinanden. Det gøres ved at give en høj temperatur. Ved høj temperatur denatureres dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenge. Så skal primerne komme tættere på de flankerende ender af det specifikke fragment eller genet af DNA'et. Primer er et kort stykke enkeltstrenget DNA, der er komplementært til målsekvensen. Forward og reverse primere annealer med de komplementære baser ved de flankerende ender af det denaturerede prøve-DNA ved annealingstemperaturen. Primere skal være varmebestandige. Når primere annealer med prøve-DNA, initierer taq-polymerase-enzym syntesen af de nye strenge ved at tilføje nukleotider, som er komplementære til mål-DNA'et. Taq polymerase er et varmestabilt enzym isoleret fra en termofil bakterie kaldet Thermus aquaticus. PCR-buffer opretholder de optimale betingelser for taq-polymerasevirkningen. Disse tre stadier af PCR-reaktioner gentages for at producere den nødvendige mængde PCR-produkt. Efter hver PCR-reaktion fordobles antallet af DNA-kopien. Derfor kan en eksponentiel amplifikation observeres i PCR. PCR-produkter kan observeres ved hjælp af gelelektroforese og kan oprenses til yderligere undersøgelser.
Figur 01: De vigtigste trin i en PCR-reaktion
PCR er et værdifuldt værktøj inden for medicinsk og biologisk forskning. PCR har en særlig værdi inden for retsmedicin, da den kan forstærke DNA til undersøgelser fra de små prøver fra de kriminelle og lave retsmedicinske DNA-profiler. PCR er meget udbredt inden for mange områder af molekylærbiologi, herunder genotypebestemmelse, genkloning, mutationsdetektion, DNA-sekventering, DNA-mikroarrays og faderskabstest osv.
Figur 02: Polymerase-kædereaktion
Hvad er DNA-sekventering?
DNA-sekventering er bestemmelsen af en præcis rækkefølge af nukleotiderne – adenin, guanin, cytosin og thymin i et givet DNA-fragment. Genetisk information lagres i DNA-sekvenserne ved hjælp af den korrekte rækkefølge af nukleotiderne. Derfor er det meget vigtigt at finde den præcise rækkefølge af nukleotiderne i et DNA-fragment at vide om genernes struktur og funktion.
DNA-sekventeringsprotokol involverer forskellige processer. Det første trin er isoleringen af interesseret DNA eller genomisk DNA fra en organisme. Ved anvendelse af PCR (som beskrevet ovenfor) skal den ønskede region af DNA'et amplificeres. Amplificeret PCR-produkt skal adskilles ved gelelektroforese og renses. Amplificerede fragmenter tjener som skabeloner til sekventering. Sekventering kan udføres enten efter Sanger-sekventering eller high throughput-sekventeringsmetode. Sanger-sekventering kræver kapillærelektroforese af resulterende DNA-fragmenter. Bestemmelse af den korrekte nukleotidrækkefølge kan foretages ved manuel læsning af autoradiografier eller ved hjælp af automatiserede DNA-sekventører.
Gensekventering bidrog til det menneskelige genom-projekt og faciliterede kortlægningen af det menneskelige genom i 2003. Inden for retsmedicin muliggjorde DNA-sekventering identifikation af individer, som viser unikke DNA-sekvenser og identificerer de kriminelle. Inden for medicin kan DNA-sekventering bruges til at opdage de gener, der er ansvarlige for genetiske og andre sygdomme, finde defekte gener og erstatte dem med korrekte gener. I landbruget bruges DNA-sekventeringsinformation fra nogle mikroorganismer til at producere transgene afgrøder med økonomisk ønskede egenskaber.
Figur 03: DNA-sekventering
Hvad er forskellen mellem PCR og DNA-sekventering?
PCR vs DNA-sekventering |
|
| PCR-processen skaber tusinder til millioner af kopier af det interesserede DNA-fragment. | DNA-sekventering er processen med at bestemme den præcise rækkefølge af nukleotiderne i et givet DNA-fragment. |
| Resultat | |
| PCR skaber tusinder til millioner af kopier af et bestemt DNA-fragment | Dette resulterer i den korrekte rækkefølge af baserne i et bestemt DNA-fragment. |
| Involvering af ddNTP'er | |
| PCR kræver ikke ddNTP'er. Den bruger dNTP'er. | DNA-sekventering kræver ddNTP'er for at afslutte strengdannelse. |
Opsummering – PCR vs DNA-sekventering
PCR og DNA-sekventering er meget vigtige værktøjer inden for mange områder af molekylærbiologi. Amplifikation af DNA-fragmenterne udføres ved PCR-teknikken, mens den korrekte rækkefølge af nukleotiderne i et DNA-fragment bestemmes af DNA-sekventeringen. Dette er forskellen mellem PCR og DNA-sekventering.
