Nøgleforskel – PCR-primere vs sekventeringsprimere
Med den seneste udvikling inden for molekylærbiologi blev der udviklet forskellige genetiske teknikker, der gjorde undersøgelsesprocesserne på forskellige veje af emnet nemme og nøjagtige. PCR og andre sekventeringsprocedurer er to vigtige sådanne teknikker. De bruger forskellige underkomponenter. Primere betragtes som den vigtigste delkomponent, der er fælles for både PCR- og sekventeringsteknikker. PCR-primere bruges til amplifikation af en bestemt DNA-sekvens, mens sekventeringsprimere anvendes i forbindelse med sekventering af et DNA-fragment med den hensigt at afsløre dets specifikke rækkefølge af nukleotidsekvensen. Dette er den vigtigste forskel mellem PCR-primere og sekventeringsprimere.
Hvad er PCR-primere?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en genetisk teknik, der bruges inden for molekylærbiologi til at amplificere en enkelt eller få kopier af et bestemt DNA-segment og opnå mange millioner identiske kopier. I en PCR-reaktion anvendes forskellige komponenter inklusive primere. Primere er korte DNA-strenge med en nukleotidlængde på 18-25, hvilket gør dem kompatible med start- og slutregionen af de DNA-fragmenter, der skal amplificeres. Primere kan være en fremadgående primer og en omvendt primer. Disse primere binder til DNA-fragmentet på de specifikke punkter, hvor det får DNA-polymerase til at binde til den specifikke primer på stedet og initiere syntesen af den nye DNA-streng.
Udvælgelsen af primere er et vigtigt aspekt af PCR-processen. Valget af primerens længde er vigtigt. Den ideelle længde ville være 18-25 nukleotider. Hvis længden er for kort eller for lang, vil primerne ikke binde til DNA-sekvensen for at blive amplificeret nøjagtigt. Primere, der er for korte i længden, fører til uspecifik primer-annealing på forskellige steder i DNA-sekvensen.
Figur 01: PCR-primere
Indholdet af guanin og cytosin (GC) i en god primer bør være i området 40-60. Primer-annealingstemperaturen og smeltetemperaturen er vitale faktorer under PCR. Smeltetemperaturen skal beregnes nøjagtigt, og primerens udglødningstemperatur skal være 5 0C lavere end smeltetemperaturen. Smeltetemperaturen skal være 60 °C og 75 °C. For høje eller for lave temperaturer vil resultere i mindre aktiv DNA-polymeraseaktivitet.
Hvad er Sequencing Primere?
Sekventeringsprimere bruges i forbindelse med sekventering af et DNA-fragment med den hensigt at afsløre dets specifikke identitet. For at opnå gode sekventeringsresultater er primere og skabeloner af høj kvalitet vigtige. Når primere udvælges, bør de således være unikke for en bestemt region, hvor vi ønsker at sekvensere. Det bør også være med en korrekt orientering, hvor sekvenserne norm alt genereres fra 3' til 5' ender af primerne. Sekvensen burde mangle uønsket selvhybridisering, såsom dannelsen af hårnålesløjfer. Det bør ikke indeholde fortløbende dannelse af guaninbaser.
Smeltetemperaturen (Tm) af primeren skal være egnet til betingelserne for sekventeringen. Derfor bør den ligge mellem 52oC og 74oC. Fremstilling af oligonukleotider, der skal anvendes som en primer, bør oprenses for at opnå den ønskede fuldlængde af sekvensen. Hvis oligonukleotiderne indeholder urenheder, vil primersekvenssignaleringen blive overlejret fra forskellige primingssteder, og det vil også reducere antallet af baseceller.
Figur 02: Sekvenseringsprimere
Primersmeltetemperaturen (Tm) af et oligonukleotid bestemmer, hvor stærke de komplementære DNA-strenge er hybridiseret med hinanden. Tm kan betragtes som en termodynamisk beregning, hvor den er afhængig af både DNA-sekvenser og flere forhold såsom s altkoncentration. Tm er vigtigt under PCR, hvor en variant kaldet cyklussekventering bruges til at producere en gruppe dideoxynukleotid-terminerede fragmenter. Her vil den primer, der sekventeres, initi alt blive annealet alternativt, derefter forlænget og til sidst denatureret til amplifikation. Derfor bør Tm-værdien være mellem 52oC og 74o C. Syntetiserede oligonukleotider kan fås fra DNA/RNA-synteselaboratorier som pr. valg. Den lille synteseskala, der bruges til DNA-sekventering, er norm alt 50 nmol. Det vigtigste er også, at de primere, der bruges til sekventering, skal renses, så de er fri for urenheder, der forhindrer kvalitetsreduktionen.
Hvad er lighederne mellem PCR-primere og sekventeringsprimere?
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er primere, der bruges i amplifikationsprocessen af en målrettet DNA-sekvens.
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er sammensat af nukleotider.
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er korte oligomerer.
Hvad er forskellen mellem PCR-primere og sekventeringsprimere?
PCR-primere vs sekventeringsprimere |
|
| PCR-primere er korte DNA-strenge med en nukleotidsekvenslængde på 18-25, hvilket gør dem kompatible med start- og slutregionen af de DNA-fragmenter, der skal amplificeres. | Sekventeringsprimere er korte oligomerer, der bruges i forbindelse med sekventering af et DNA-fragment med den hensigt at afsløre dets specifikke identitet. |
| Funktion | |
| PCR-primere bruges til amplifikation af en bestemt DNA-sekvens. | Sekventeringsprimere bruges i forbindelse med sekventering af et DNA-fragment med den hensigt at afsløre dets specifikke identitet. |
| Nødvendigt antal primere | |
| To primere; en fremadgående primer og en omvendt primer bruges som PCR-primere. | Har kun brug for én primer som sekventeringsprimer. |
Opsummering – PCR-primere vs sekventeringsprimere
Sekventeringsprimere bruges i forbindelse med sekventering af et DNA-fragment med den hensigt at afsløre dets specifikke identitet. En sekventeringsprimer vil være nok til at køre processen. For at opnå gode sekventeringsresultater er primere og skabeloner af høj kvalitet vigtige. Når primere udvælges, bør de således være unikke for en bestemt region, hvor vi ønsker at sekvensere. PCR-primere er korte DNA-strenge med en nukleotidlængde på 18-25, som er kompatibel med start- og slutregionen af de DNA-fragmenter, der skal amplificeres. PCR-primere kan være en fremadgående primer og en omvendt primer. Indholdet af guanin og cytosin (GC) i en god primer bør være i området 40-60. Primer-annealingstemperaturen og smeltetemperaturen er vitale aspekter under PCR. Dette er forskellen mellem PCR-primere og sekventeringsprimere.
