Nøgleforskel – RT PCR vs QPCR
Polymerase-kædereaktion er en teknik, der bruges til at amplificere en specifik region af DNA in vitro. På grund af opfindelsen af denne teknik af Kary Mullis i 1983, er videnskabsmænd i stand til at lave tusind til millioner af kopier af specifikke DNA-fragmenter til forskningsformål. I øjeblikket er det blevet en almindelig og rutinemæssigt udført teknik i kliniske og forskningslaboratorier til en bred vifte af applikationer. Der er variationer af traditionel PCR-teknik såsom RT PCR, indlejret PCR, multipleks PCR, Q PCR, RT – QPCR osv. RT PCR og Q PCR er to vigtige variationer af PCR. Den vigtigste forskel mellem RT PCR og Q PCR er, at RT PCR bruges til at detektere genekspression gennem skabelse af komplementære DNA (cDNA) transkripter fra RNA, mens Q PCR bruges til kvantitativt at måle PCR-produkterne i re altid ved hjælp af fluorescerende farvestoffer.
Hvad er RT PCR?
Omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (RT PCR) er en variant af PCR, som bruges til at påvise RNA-ekspression. Det er en meget vigtig metode til at påvise mRNA-ekspression i væv. RT PCR anvendes, når prøvens udgangsmateriale er RNA. I RT PCR omdannes skabelon-mRNA'et først til komplementært DNA. Dette trin katalyseres af enzymet revers transkriptase, og processen er kendt som revers transkription. For det andet anvendes traditionel PCR til det nyligt syntetiserede cDNA til amplifikationen.
RT PCR er en meget følsom teknik, som kræver en relativt lille mængde RNA-prøve. RT PCR er almindeligt anvendt til diagnosticering og kvantificering af RNA-arter, især RNA-vira såsom human immundefektvirus og hepatitis C-virus.
Figur 01: RT PCR-teknik
Hvad er QPCR?
Quantitative PCR (QPCR) er en variant af PCR, som bruges til kvantitativ måling af PCR-produkterne. Det omtales også som real-time polymerase-kædereaktion, da det måler amplifikationen af re altid ved hjælp af real-time PCR-maskine. Det er en egnet metode til at bestemme mængden af en målsekvens eller gen til stede i en prøve. Det interessante ved QPCR er, at det kombinerer både amplifikation og ægte kvantificering i et enkelt trin. Derfor kan behovet for gelelektroforese ved detektion elimineres ved QPCR-teknik. QPCR bruger fluorescerende farvestoffer til at mærke PCR-produkter under PCR-reaktionerne, som til sidst fører til direkte kvantificering. Når PCR-produkterne akkumuleres, akkumuleres de fluorescerende signaler også, og det vil blive målt af re altidsmaskinen. QPCR kan kombineres med RT PCR. Det er kendt som RT – QPCR eller QRT – PCR og betragtes som en mest kraftfuld, følsom og kvantitativ metode til påvisning af RNA-niveauer i celler eller væv.
SYBR Green og Taqman er to metoder, der anvendes til at detektere eller se forstærkningsprocessen af re altids-PCR. SYBR Green-metoden udføres ved hjælp af et fluorescerende farvestof kaldet SYBR green og detekterer amplifikationen ved at binde farvestoffet til at producere dobbeltstrenget DNA. Taqman udføres ved hjælp af dobbeltmærkede prober og detekterer amplifikationen ved nedbrydning af proben med Taq-polymerase og frigivelser af fluoroforen som vist i figur 02. Begge metoder overvåger amplifikationsprocessens fremskridt og rapporterer mængden af produktet i re altid.
PCR i re altid har en bred vifte af anvendelser, såsom kvantificering af genekspression, mikroRNA og ikke-kodende RNA-analyse, SNP-genotypning, påvisning af kopiantalvarianter, påvisning af sjældne mutationer, påvisning af genetisk modificerede organismer, påvisning af smitsomme stoffer osv.
Figur 02: Kvantitativ PCR-teknik
Hvad er forskellen mellem RT PCR og QPCR?
RT PCR vs. QPCR |
|
| RT PCR er en teknik, der bruges til at detektere genekspression ved amplifikation. | QPCR er en teknik, som amplificerer DNA og kvantificerer PCR-produkterne i re altid. |
| Involvering af Reverse Transcriptase Enzyme | |
| Enzym revers transkriptase bruges til RT PCR. | Enzym revers transkriptase bruges ikke til QPCR. |
| Brug af fluorescensmærkede molekyler | |
| Fluorescensmærkede farvestoffer eller prober bruges ikke til RT PCR. | Fluorescensmærkede farvestoffer eller prober bruges til QPCR. |
| Kvantificering af PCR-produkt | |
| Medmindre den er koblet til QPCR, kvantificerer RT PCR ikke PCR-produktet. | QPCR måler PCR-produktet kvantitativt. |
| Startmateriale | |
| Udgangsmateriale er mRNA. | Udgangsmateriale er DNA. |
| Syntese af cDNA | |
| Komplementært DNA produceres under RT PCR. | Komplementært DNA produceres ikke under QPCR. |
Oversigt – RT PCR vs QPCR
RT PCR og QPCR er to versioner af traditionel PCR. RT PCR-teknik udføres for mRNA-prøver, og den drives af revers transkription og produktion af cDNA. QPCR bruges til at kvantificere PCR-produkter under re altids-PCR-termiske cyklusser ved hjælp af fluorescerende farvestoffer eller mærkede prober. I QPCR er mængden af PCR-produkt repræsenteret af de udsendte fluorescerende signaler af prøven. RT PCR bruges populært som en amplifikationsproces, mens QPCR almindeligvis bruges som en kvantificeringsproces. Dette er forskellen mellem RT PCR og QPCR.
