Nøgleforskel – Genkloning vs PCR
Syntesen af mange kopier af DNA fra et specifikt DNA-fragment kaldes DNA-amplifikation. Der er to vigtigste DNA-amplifikationsprocesser, nemlig genkloning og PCR. Den vigtigste forskel mellem genkloning og PCR er, genkloning producerer de mange kopier af et specifikt gen in vivo ved at konstruere et rekombinant DNA og vokse inde i en værtsbakterie, mens PCR producerer millioner af kopier af et specifikt DNA-fragment in vitro, der gennemgår gentagne cyklusser af denaturering og syntese.
Hvad er genkloning?
Genkloning er en teknik, der anvendes til at lokalisere og multiplicere et specifikt gen fra det ekstraherede genomiske DNA fra en organisme gennem konstruktion af rekombinant DNA. Genomisk DNA indeholder tusindvis af forskellige gener kodet for proteiner. Når DNA ekstraheres, inkluderer det alle mulige gener, det kan bære. Genkloningsteknik har gjort det muligt at påvise et specifikt gen fra det samlede DNA. Derfor tjener genkloning som et vigtigt værktøj i molekylærbiologi.
Oprettelse af et genomisk bibliotek af en organisme er afgørende i genkloning, hvis der ikke er nogen anelse om placeringen af det relevante gen i DNA'et. Et genomisk bibliotek er lavet ved hjælp af følgende trin.
Trin 1: Ekstraktion af det samlede DNA fra en organisme, som indeholder det ønskede gen.
Trin 2: Restriktionsfordøjelse af det ekstraherede DNA for at producere små håndterbare fragmenter. Dette trin lettes af restriktionsendonukleaser.
Trin 3: Udvælgelse af en egnet vektor og åbning af vektor-DNA'et med de samme restriktionsendonukleaser. Bakterieplasmider bruges almindeligvis som vektorer til at bære fremmed DNA. Plasmider er små cirkler af DNA placeret i bakterier.
Trin 4: Kombination af vektor-DNA'et og fragmenteret DNA for at producere rekombinant DNA-molekyle. Dette trin er styret af DNA-ligase.
Trin 5: Overførsel af rekombinante DNA-molekyler til værtsbakterier. Dette trin er kendt som transformation og udføres ved hjælp af et varmechok.
Trin 5: Screening af transformerede bakterieceller på et dyrkningsmedium. En blandet population af transformerede og ikke-transformerede værtsceller opnås ved slutningen af transformationsprocessen. Som gen af interesse omfatter kun transformerede værtsceller. Derfor er det nødvendigt at vælge transformerede celler. Udvælgelsen foretages ved hjælp af selektive medier, som indeholder antibiotika. Kun de transformerede celler vokser på dette screeningsmedium, hvilket muliggør selektion.
Trin 6: Dyrkning af bakterier for at producere et genbibliotek. I dette trin indføres de transformerede værtsceller i friske dyrkningsmedier, som tilvejebringer optimale vækstkrav. Samlede kolonier på kulturpladerne repræsenterer den organismes genomiske bibliotek.
Trin 7: Det rekombinante DNA-molekyle, der indeholder genet af interesse, skal screenes fra tusindvis af klonede fragmenter af rekombinant DNA. Det kan opnås ved brug af prober, der markerer det specifikke gen eller det specifikke protein, der er resultatet af det gen.
Når det interesserede gen, der indeholder bakteriekolonien, er identificeret fra de samlede kolonier, er det muligt at lave millioner af kopier af det rekombinante plasmid, der indeholder genet.
Genkloning bruges til etablering af genbiblioteker, fremstilling af specielt protein, vitaminer, antibiotika, hormoner, sekventering og kortlægning af genomer af organismer, fremstilling af flere kopier af individers DNA i retsmedicin osv.
Figure_1: Genkloning
Hvad er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en teknik, som genererer et stort antal kopier af et bestemt DNA-fragment. Eksponentiel amplifikation af en specifik DNA-sekvens opnås ved PCR under in vitro-betingelser. Denne teknik er et meget kraftfuldt værktøj inden for molekylærbiologi, da den kan formere en lille prøve af DNA til en brugbar mængde. PCR blev introduceret af Kary Mullis i 1983, og denne prisvindende opfindelse skabte et stort fremskridt inden for molekylærbiologi.
PCR-teknik følger gentagne PCR-reaktioner som vist i figur 02. En PCR-reaktion består af tre hovedtrin, der forekommer ved tre forskellige temperaturer; denaturering af dobbeltstrenget ved DNA ved 94 0C, annealing af primere ved 68 0C og strengforlængelse ved 72 0 C. Derfor, når PCR udføres, bør temperaturudsving opretholdes i høj grad for korrekt replikation. PCR udføres i en PCR-maskine inde i PCR-rør. PCR-rør er fyldt med korrekte PCR-blandinger indeholdende template-DNA, Taq-polymerase, primere, dNTP'er og buffer. Denaturering af dobbeltstrenget prøve-DNA til enkeltstrenget DNA udføres ved at bryde hydrogenbindingerne mellem komplementære baser ved 94 – 98 0C. Derefter eksponeres enkeltstrenge af template-DNA for primere. Der skal medfølge et par primere (fremad og baglæns), og de skal være termostabile til at tåle høje temperaturer. Primere er enkeltstrengede korte DNA-sekvenser komplementære til enderne af mål-DNA-fragmentet. Syntetiske primere anvendes i PCR. Primere binder med de komplementære baser af prøve-DNA og initierer syntesen af en ny streng. Dette trin katalyseres af et enzym kaldet Taq polymerase; et termostabilt DNA-polymeraseenzym isoleret fra Thermus auqaticus. Når primere og nukleotider (byggesten) er tilgængelige, konstruerer Taq-polymerase den nye DNA-streng, der er komplementær til template-DNA. Ved afslutningen af PCR-programmet observeres amplificeret DNA-fragment ved anvendelse af gelelektroforese. Hvis yderligere analyse er påkrævet, renses PCR-produktet fra gelen.
PCR er meget nyttigt til diagnosticering og overvågning af genetiske og erhvervede sygdomme, identifikation af kriminelle (inden for retsmedicin), undersøgelse af strukturen og funktionen af et målrettet DNA-segment, sekventering og kortlægning af genomer af organismer, osv. PCR er blevet en rutinemæssig laboratorieteknik i medicinske og molekylærbiologiske forskningslaboratorier blandt forskere, da den har en bred vifte af anvendelser.
Figur_2: Polymerase-kædereaktion
Hvad er forskellen mellem genkloning og PCR?
Genkloning vs. PCR |
|
| Genkloning er processen med at lave flere kopier af et specifikt gen in vivo gennem rekombinant DNA og transformere til en værtsbakterie. | PCR-teknikken producerer flere kopier af en bestemt DNA-sekvens in vitro gennem gentagne cyklusser af PCR-reaktioner. |
| Krav til konstruktion af rekombinant DNA | |
| Rekombinant DNA produceres for at lokalisere genet. | Rekombinant DNA produceres ikke. |
| Need of Labour | |
| Denne proces er arbejdskrævende. | Intensiv arbejdskraft er ikke nødvendig. |
| In vivo- eller in vitro-proces | |
| Konstruktion af rekombinant DNA er in vitro, og amplifikationen af DNA er in vivo. | Amplifikationen af DNA sker fuldstændig in vitro. |
Opsummering – Genkloning vs PCR
Genkloning og PCR er to metoder, der bruges til DNA-amplifikation. PCR er en in vitro-proces, som laver flere kopier af DNA af et bestemt DNA-fragment uden brug af rekombinant DNA og en værtsorganisme. Genkloning er primært en in vivo proces, som resulterer i flere kopier af et interesseret gen inde i værtsorganismen via konstruktion af rekombinant DNA. Dette er forskellen mellem genkloning og PCR.
